miR-340調控UVB誘導的黑素細胞樹突形成的機制研究.pdf

1、人體皮膚的顏色主要受色素沉著過程的影響,色素沉著過程也就是黑素代謝的生理過程,包括黑素合成、轉運、再分布和降解。在多種外界環(huán)境因素和生理因素影響下,機體形成一個復雜而有序的色素沉著調控網(wǎng)絡[1]。色素沉著異常在臨床上表現(xiàn)為多種色素障礙性皮膚病,發(fā)病機制尚不完全清楚。
　　黑素轉運是色素沉著過程中最為關鍵的一個環(huán)節(jié),黑素合成后,必須由黑素細胞進入角質形成細胞,才能形成皮膚顏色并保護機體免受紫外線輻射損傷。黑素轉運主要分為①細胞內轉運

2、:黑素細胞內合成的黑素小體由核周向樹突末端運動;②細胞間轉運:運動至樹突末端的黑素小體分泌進入周圍角質形成細胞。樹突是黑素細胞的特征性結構,作為黑素小體的運動管道和連接黑素細胞與角質形成細胞的重要中介,樹突在黑素轉運中起著至關重要的作用。紫外線是引起色沉增加的重要影響因素,紫外線照射在刺激黑素細胞黑素合成的同時,通過增加樹突數(shù)量及長度實現(xiàn)更高效的黑素轉運[2-3]。有學者通過體外重建表皮模型證實中波紫外線(UVB)照射顯著促進黑素小體轉

3、運,鏡下觀察黑素顆粒在表皮全層分布,黑素細胞數(shù)量及形態(tài)發(fā)生明顯變化[4]。我們在前期實驗中也證實UVB照射后可以誘導人黑素細胞PIG1樹突數(shù)量及長度顯著增加,黑素小體向角質形成細胞的傳遞增強[5],但具體機制尚未完全闡明。
　　microRNA(miRNA)是一類長約22個nt的非編碼單鏈小RNA分子,可以通過與其調控的靶基因之間特異性的結合,降解靶mRNA或抑制翻譯等方式在轉錄后水平調控靶基因表達,進而參多種生物學功能,在細胞內

4、具有重要的調節(jié)作用。miRNAs表達的時序性和組織特異性提示miRNAs的分布可能決定細胞和組織的功能特異性。既往有研究表明一些microRNAs參與調控神經(jīng)細胞樹突棘發(fā)育[6-8],還有很多報道m(xù)iRNAs分子通過調控細胞骨架蛋白等信號通路,在細胞形態(tài)學發(fā)生、遷移及運動中發(fā)揮重要的調控作用[9-11]。此外,研究發(fā)現(xiàn)紫外線可以引起細胞內microRNA表達譜變化,miRNAs分子可以在轉錄后水平參與調控對UV誘導DNA損傷的應答機制[

5、12]。以上提示我們在黑素細胞內可能存在特定的miRNAs分子參與調控樹突形態(tài)。因此,本課題擬在前期研究的基礎上,選擇100mJ/cm2UVB作為誘導條件,尋找與人表皮黑素細胞樹突形成相關的microRNA分子,研究miRNAs調控黑素細胞形態(tài)的分子機制及其在UVB誘導的樹突形成中的作用,完善黑素代謝基礎理論,探討miRNAs參與紫外線誘導皮膚色沉的分子機制,并為色素障礙性皮膚病的治療以及皮膚美容產品的研發(fā)提供新的思路和理論依據(jù)。

6、>　　實驗方法:
　　使用100mJ/cm2UVB照射人表皮黑素細胞PIG1,與UVB照射前的黑素細胞進行microRNA表達譜差異分析,再通過Real-timePCR驗證芯片結果,初步篩選相關的miRNA分子。轉染miRNA分子進行形態(tài)學和功能學研究,觀察黑素細胞樹突數(shù)量及長度的變化,觀察骨架蛋白F-actin和黑素小體在樹突的分布變化。生物信息預測軟件預測miRNA可能調控的靶基因,雙熒光素酶報告載體驗證預測的靶基因,RT-P

7、CR、WesternBlot證實miRNA分子對靶基因的調控作用。
　　結果:
　　1.對microRNA芯片表達譜進行分析后,我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比,UVB照射后很多microRNA表達水平發(fā)生變化,UVB照射后3h與對照組相比有12個miR分子表達變化(Foldchange≥2.0),其中2個下調,10個上調。UVB照射后24h,有3個顯著變化的miR分子(Foldchange≥2.0),其中1個上調,3個下調。
　

8、　2.在黑素細胞中轉染miR-340擬似物和抑制物后,分別成功上調和下調miR-340表達水平,與對照組相比,上調miR-340表達水平后,黑素細胞樹突數(shù)量、長度均顯著增加(p<0.05);免疫熒光觀察到細胞內F-actin形成的應力纖維解聚,黑素小體在樹突末端的分布增加。
　　3.通過生物學軟件我們預測RhoA是miR-340的靶基因,報告基因實驗證實,miR-340可以與RhoA3’UTR的預測位點特異性結合,RT-PCR和W

9、esternblot實驗發(fā)現(xiàn)上調miR-340表達水平,RhoA的mRNA表達水平無明顯變化,而RhoA蛋白水平顯著下調;下調miR-340表達水平,RhoA的mRNA無變化,蛋白水平上調。
　　結論:
　　1.UVB照射可以誘導人黑素細胞PIG1的microRNA表達譜發(fā)生變化,靶基因預測和功能學分析提示microRNA可能參與多種生物學功能;UVB照射后microRNAs表達的時間差異性,提示UVB誘導的miRNAs表達

10、具有瞬時性,并且多集中于UVB照射早期。
　　2.miR-340在UVB照射前后的人黑素細胞表達具有差異性;miR-340能夠促使PIG1細胞內應力纖維解聚,黑素細胞樹突長度及數(shù)量增加,黑素小體向樹突末端的轉運增加,說明miR-340在黑素細胞樹突形成及黑素轉運中的調控作用。
　　3.miR-340可能通過與靶基因RhoA3’UTR區(qū)的作用位點特異性結合抑制RhoA表達,參與黑素細胞樹突形成。RhoA是調控骨架蛋白F-act