人骨髓間充質干細胞成骨及成軟骨分化中長鏈非編碼RNA的初步研究.pdf

1、間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的多潛能干細胞，其具有很強的自我更新和多項分化潛能。在給予適宜的體內(nèi)或體外誘導環(huán)境下，其可分化為成骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞等。間充質干細胞是骨與軟骨組織工程研究常用的種子細胞，在再生醫(yī)學研究中具有廣闊的應用前景。骨髓來源的間充質干細胞因獲取和培養(yǎng)簡單方便，是目前使用最為廣泛、研究最多的間充質干細胞。間充質干細胞的成骨、成軟骨定向分化是干細胞研究的熱點，

2、目前其具體的定向分化機制仍不明了。
　　長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度超過200nt、不編碼蛋白的RNA。其占到非編碼RNA的80％以上，但卻是目前研究及了解最少的一類RNA。其不具有蛋白編碼功能，但研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在生長發(fā)育與分化過程中發(fā)揮重要作用。lncRNA具有復雜的生物學功能，參與機體諸多生物學行為，并與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治有密切的關系。然而關于lncRN

3、A在人骨髓間充質干細胞成骨、成軟骨定向分化過程中的作用尚無系統(tǒng)的報道和研究。該研究對于間充質干細胞定向分化過程中的lncRNAs進行了初步篩選，為后續(xù)的機制研究奠定了基礎。
　　目的:
　　1.對人骨髓間充質干細胞進行成骨及成軟骨誘導分化，為篩選與定向分化有關的lncRNA提供細胞樣本。
　　2.利用Agilent human lncRNA+mRNA Array V4.0微陣列芯片技術分別篩選人骨髓間充質干細胞成骨分化

4、組與未分化組、成軟骨分化組與未分化組之間差異表達的lncRNAs和mRNAs。
　　3.利用生物信息學技術對差異表達的lncRNA和mRNA進行分析，篩選可能參與定向分化過程的lncRNA，預測其潛在的生物學功能。
　　研究方法:
　　1.對人骨髓間充質干細胞進行細胞培養(yǎng)，對P3 MSCs分別進行成骨及成軟骨誘導分化，分別設立實驗組及對照組。在誘導分化后Day14進行細胞染色及相關基因的檢測進行誘導分化的驗證。

5、　　2.分別取3個成骨誘導分化、3個成軟骨誘導分化和3個正常培養(yǎng)未分化Day14的細胞樣本作為芯片檢測樣品，提取細胞樣本的總RNA。經(jīng)質控合格后，利用Agilent human lncRNA+mRNA Array V4.0微陣列芯片技術對定向分化組與對照組之間差異表達的lncRNAs和mRNAs進行篩選。
　　3.通過Gene Ontology、Pathway分析以及構建lncRNA和mRNA的共表達CNC網(wǎng)絡圖等生物信息學分析，

6、進一步分析差異表達的lncRNAs，篩選可能與定向分化有關的lncRNAs，初步探討其生物學功能。
　　4.采用qRT-PCR對芯片檢測結果進行驗證，并檢測感興趣的相關的lncRNAs在定向分化過程中的動態(tài)表達情況。
　　研究結果:
　　1.我們對MSCs原代細胞進行培養(yǎng)，在傳代培養(yǎng)至P3時分別進行成骨及成軟骨誘導分化。我們采用ALP、茜素紅染色及成骨相關基因ALP、Runx2及ColⅠ的檢測進行成骨分化的鑒定。對于成

7、軟骨分化，阿利新藍染色、免疫組化染色(Aggrecan、Sox-9、ColⅡ)以及成軟骨相關基因Aggrecan、Sox-9、ColⅡ的檢測均表明了其成功誘導。
　　2.通過對芯片檢測結果進行初步分析整理，成骨分化組與未分化組間共有1206條lncRNAs差異表達(FC＞2.0或＜-2.0，P-value＜0.05)，其中差異高表達的lncRNAs有687條，差異低表達的519條。另外，差異表達的mRNAs共2143條，其中上調(diào)表

8、達的mRNA有957條，下調(diào)表達的mRNA有1186條。qRT-PCR對其表達情況進行驗證，結果與芯片結果一致。
　　3.成軟骨分化組與未分化組間共有3638條lncRNAs差異表達(FC＞2.0或＜-2.0，P-value＜0.05)，其中差異高表達2166條，差異低表達1472條。差異表達的mRNAs共5560條，其中上調(diào)1980條，下調(diào)3580條。qRT-PCR的驗證結果與芯片結果一致。
　　4.通過GO、Pathwa

9、y分析及CNC網(wǎng)絡圖構建，對相關的lncRNAs進行了分析及生物學功能的預測。分別對lncRNA-H19和uc022axw.1在成骨分化過程中以及l(fā)ncRNA-ZBED3-AS1和CTA-941F9.9在成軟骨分化過程中的動態(tài)表達情況進行了觀察，提示其可能參與MSCs的定向分化過程。
　　結論:
　　1.本實驗研究以人骨髓間充質干細胞為研究對象，對其進行了成骨及成軟骨誘導分化，并進行了細胞染色和分化相關基因的檢測進行了驗證，

10、為芯片檢測提供了可靠的細胞樣本。
　　2.首次系統(tǒng)報告通過微陣列芯片篩選了入骨髓間充質干細胞成骨、成軟骨分化與未分化之間間差異表達的lncRNAs和mRNAs，并通過GO、Pathway分析以及CNC網(wǎng)絡圖構建等生物信息學技術對差異表達的lncRNAs和mRNAs進行分析，初步探討了lncRNA的生物學作用。
　　3.lncRNAs在MSCs成骨及成軟骨分化過程中存在差異表達，提示其可能在定向分化過程中的潛在作用。關于lnc