基因組編輯技術介導的豬GGTA1-ASGR1基因敲除研究.pdf

1、供體肝臟的嚴重短缺是限制臨床肝移植的主要瓶頸，利用豬肝臟進行異種肝移植是有望解決臨床供肝短缺的有效途徑之一。尤其是作為“過渡肝”應用于24h內即會發(fā)生死亡的急性肝衰病人的治療，可以降低病人的死亡率，為后續(xù)治療爭取時間。豬-人異種肝臟移植面臨諸多障礙，其中超急性免疫排斥反應和血小板減少癥是兩個首要攻克難題。豬α-1,3-半乳糖基轉移酶基因（GGTA1）催化形成的αGal表位抗原，與人體天然存在的αGal表位抗體結合會引發(fā)超急性免疫排斥反應

2、。表達于豬肝竇內皮細胞和Kuffer細胞的去唾液酸糖蛋白受體1（ASGR1）是誘發(fā)異種肝移植后受體發(fā)生血小板減少癥的主要誘因。本研究利用基因組編輯技術轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)和規(guī)律成簇間隔短回文重復（CRISPR/Cas9）分別介導豬GGTA1和ASGR1基因的敲除，結合體細胞核移植技術快速高效地制備了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型豬模型，在避免超急性排斥反應的同時減緩血小板減少癥，以期為異種肝移植的研究提供

3、更好的材料。
　　本學術論文有兩項研究內容，研究結果如下：
　　1、利用TALEN技術高效制備GGTA1基因敲除五指山小型豬。針對豬GGTA1基因第4外顯子設計并構建兩對TALENs打靶載體，將TALEN mRNA電轉染豬耳成纖維細胞，經傳代培養(yǎng)后采用免疫磁珠法高效富集獲得47個單細胞克隆，PCR測序鑒定均為GGTA1基因突變細胞，基因編輯效率高達100％。選擇6種不同突變類型的GGTA1雙等位基因敲除細胞為核供體進行體細胞

4、核移植，共移植6頭受體母豬，6頭均妊娠至終期共產克隆仔豬23頭，采集仔豬耳組織樣提取基因組DNA進行PCR測序鑒定，證實全部為GGTA1基因敲除仔豬。對TALEN的17個潛在脫靶位點設計引物，PCR目的片段后測序，未發(fā)現脫靶現象。流式細胞術分析結果顯示，仔豬α-Gal表位成功去除。血清裂解結果顯示，GGTA1基因敲除豬細胞能夠有效抵抗正常人血清的排斥反應，表明有效克服了超急性免疫排斥。
　　上述結果表明，TALEN技術結合免疫磁珠

5、方法可高效敲除GGTA1基因，通過體細胞核移植技術快速獲得GGTA1雙等位基因敲除仔豬，成功克服了超急性免疫排斥。
　　2、本研究在GGTA1敲除的五指山小型豬基礎上，利用CRISPR/Cas9結合體細胞核移植技術制備 ASGR1基因敲除豬，為異種肝移植后血小板減少癥的研究提供良好的動物模型。針對豬ASGR1基因設計并構建了靶向表達載體單鏈導向RNA1(sgRNA1)，將sgRNA1與增強綠色熒光蛋白（EGFP）質粒共同電轉染GG

6、TA1基因敲除豬耳成纖維細胞，流式細胞術富集表達綠色熒光的細胞后培養(yǎng)單細胞克隆。實驗結果表明，共挑取細胞克隆41個，經PCR產物測序，其中37個克隆發(fā)生基因突變，ASGR1基因突變效率為90%；雙等位基因敲除的細胞克隆30個，雙等位基因敲除效率為73%。選擇四個ASGR1基因敲除類型不同的細胞為核供體進行核移植至4頭受體豬，2頭妊娠至終期，產仔豬6頭，經PCR產物測序，所有6頭仔豬均為ASGR1基因敲除豬；Western Blot顯示A

7、SGR1基因敲除仔豬的肝臟中沒有ASGR1的表達。對sgRNA1的13個潛在脫靶位點，分別設計引物進行PCR擴增和測序，未檢測到脫靶現象。總之，本研究利用 CRISPR/Cas9快速高效地制備了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型豬模型，有望解決異種肝移植后出現的血小板減少癥。
　　綜上所述，本研究利用基因組編輯技術在豬體細胞實現了精確的基因編輯，結合體細胞核移植技術快速高效地制備了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型豬模