膠質瘤間質-上皮轉化的傾向及白藜蘆醇對其的調節(jié)作用.pdf

1、目的:
　　膠質瘤(glioma)是最為常見的中樞神經系統(tǒng)惡性腫瘤,具有較高的侵襲性,邊界不清晰,故單純的手術切除無法達到治療效果。大量的研究表明,上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及與其逆反的間質-上皮轉化（mesenchymal-to-epithelial transition,MET）與腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間存在一定的聯(lián)系。EMT能夠促進腫瘤的遠端轉移與異位侵襲,而ME

2、T能夠促進腫瘤細胞的增殖與分化。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是具有抗癌作用的天然多酚類化合物,對膠質瘤具有一定的抗腫瘤作用。本實驗室前期的蛋白質組學數(shù)據(jù)的分析表明,膠質母細胞瘤細胞系經白藜蘆醇處理后,角蛋白17(KRT17)的表達水平明顯下調。因KRT17是上皮性腫瘤的標志物,說明白藜蘆醇能夠降低膠質母細胞瘤中上皮特性分子的異常高表達。因此,本實驗旨在證明人膠質瘤中具有間質-上皮轉化的傾向,并分析膠質母細胞瘤細胞系中白藜蘆

3、醇對間質-上皮轉化的調節(jié)作用。具體研究內容如下:
　　1.檢測KRT17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin在膠質瘤組織中的表達情況,并分析它們與腫瘤分級之間的相關性;
　　2.分析KRT17與E-cadherin之間的相關性;
　　3.檢測膠質母細胞瘤細胞系LN428、LN18及U251對白藜蘆醇的敏感性;
　　4.檢測白藜蘆醇處理前后,LN428、LN18及U251中KRT17、E

4、-cadherin、N-cadherin及β-catenin中的表達情況;
　　5.檢測β-catenin在LN428、LN18及U251中的核易位情況及白藜蘆醇對其的作用;
　　6.揭示膠質瘤組織中MET的傾向,以及白藜蘆醇對這一傾向的逆轉作用與意義。
　　方法:
　　利用石蠟組織微陣列技術及免疫組織化學染色(IHC)檢測KRT17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin在95例人膠質瘤

5、組織中的表達情況,并利用SPSS18對它們與腫瘤分級之間的關系以及KRT17與E-cadherin、β-catenin之間的相關性進行統(tǒng)計學分析;采用H-E染色和MTT法檢測膠質母細胞瘤細胞系LN428、LN18及U251對于白藜蘆醇的藥物敏感性;通過RT-PCR、免疫細胞化學(ICC)、Western-blotting方法檢測,100μM白藜蘆醇處理48小時前后,KRT17、E-cadherin、N-cadherin及β-cateni

6、n的表達情況;采用免疫熒光技術(IF)檢測β-catenin在LN428、LN18及U251中的核易位情況及白藜蘆醇對其的影響。
　　結果:
　　1.膠質瘤組織中KRT17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin的IHC檢測:
　　(1)陽性率比較:KRT17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin在膠質瘤組織中的陽性率分別為67.8％、27.8％、100％、92.2％,

7、瘤旁組織中的陽性率分別為0％、20％、100％、60％,其中KRT17和β-catenin在膠質瘤中的陽性率高于瘤旁組織。
　　(2)與腫瘤分級的相關性分析:β-catenin的表達水平與膠質瘤分級間呈正相關(β=0.045,r=0.212);KRT17(p=0.493,r=0.028)、E-cadherin(p=0.474,r=-0.017)、N-cadherin(p=0.499,r=0.014)與膠質瘤分級間的相關性分析均不具

8、有統(tǒng)計學意義。
　　(3) KRT17與E-cadherin的表達水平之間呈正相關,具有顯著的統(tǒng)計學意義(p=0.023,r=0.232)。
　　2.白藜蘆醇敏感性的檢測:HE染色和MTT法的結果顯示,LN428在經過白藜蘆醇處理后,細胞數(shù)目基本不變,細胞形態(tài)無明顯變化,具有耐藥性;LN18加藥后,細胞數(shù)目略有減少,形態(tài)變化不明顯,不具有絕對的敏感性;U251加藥后,細胞數(shù)目大量減少,形態(tài)發(fā)生明顯變化,對于白藜蘆醇十分敏感。

9、
　　3.MET相關分子表達情況的檢測:
　　(1)細胞骨架蛋白KRT17:LN428中呈強陽性表達,經白藜蘆醇處理后,其PCR、ICC及Western的結果均顯示表達水平明顯下調;在LN18和U251中呈近陰性表達。
　　(2)上皮標志物E-cadherin:LN428中呈陽性表達,加藥后表達水平略有下調;LN18的PCR結果顯示其有表達,但ICC及Western顯示陰性表達;U251中呈陰性表達。
　　(3)

10、間質標志物N-cadherin:在LN428、LN18及U251中都呈陽性表達,LN428中表達水平下調;LN18中表達基本無差異;U251的PCR顯示無差異,ICC及Western顯示表達略有下調。
　　(4)連環(huán)蛋白β-catenin:LN428中呈陽性表達,加藥后PCR顯示不變,ICC及Western顯示表達水平下調;LN18及U251中弱表達,無明顯差異。
　　4.IF檢測結果顯示,LN428中發(fā)生了β-cateni

11、n的核易位,在經過白藜蘆醇處理后其核內β-catenin的表達水平下調。
　　結論：
　　1.KRT17、E-cadherin在膠質瘤組織中的陽性率分別為67.8％、27.8％,高于瘤旁組織中的陽性率0％、20％;這些上皮標志分子表達的增強,提示膠質瘤中具有間質-上皮轉化的傾向。
　　2.β-catenin的表達水平與膠質瘤分級間呈正相關(p=0.045,r=0.212),說明隨著腫瘤惡性程度的增加,其增殖的能力也隨之

12、增強;KRT17與E-cadherin的表達之間呈正相關(p=0.023,r=0.212),提示這兩種上皮標志物之間具有一定的聯(lián)系。
　　3.經白藜蘆醇處理后,膠質母細胞瘤細胞系中KRT17、E-cadherin的表達水平降低,說明其上皮特性減弱,向間質特性轉化;N-cadherin及核易位的β-catenin的表達水平降低,說明白藜蘆醇在逆轉其間質-上皮轉化的同時,誘導腫瘤細胞凋亡,并抑制其增殖,從而發(fā)揮抗癌效應。
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