紫花苜蓿無(wú)序蛋白MsZFP基因的克隆及功能研究.pdf

1、固有無(wú)序蛋白是一類(lèi)存在多種動(dòng)態(tài)互變結(jié)構(gòu)，具有正常的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。在分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，固有無(wú)序蛋白通過(guò)與多種分子結(jié)合，引入復(fù)雜的多樣性互作，進(jìn)而在植物適應(yīng)逆境和脅迫應(yīng)答方面起到重要作用。MsZFP是一種轉(zhuǎn)錄因子具有手指狀結(jié)構(gòu)域，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其為固有無(wú)序蛋白，在細(xì)胞分化、基因表達(dá)調(diào)控、胚胎發(fā)育、增強(qiáng)植物脅迫的耐受性等方面具有重要作用。本研究從紫花苜蓿（Medicago sativa L）中克隆得到MsZFP基因，對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化

2、，為MsZFP基因功能及紫花苜?？鼓鏅C(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1. MsZFP基因的克隆與序列分析
　　通過(guò)RT-PCR方法克隆了MsZFP基因，該基因含有762 bp的開(kāi)放讀碼框，編碼253個(gè)氨基酸。具有2個(gè)保守的單C2H2型結(jié)構(gòu)域。對(duì)其開(kāi)放讀碼框氨基酸進(jìn)行無(wú)序性分析，發(fā)現(xiàn)其為固有無(wú)序蛋白。通過(guò)與其它物種中MsZFP近源基因的比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿MsZFP基因與蒺藜苜蓿、大豆、花生等物種中近源基

3、因的親緣關(guān)系較近。
　　2. pCBM-MsZFP植物表達(dá)載體的構(gòu)建
　　構(gòu)建了含有MsZFP基因的植物表達(dá)載體pCBM-35S-MsZFP，含有草丁膦篩選標(biāo)記基因PPT和組成型啟動(dòng)子35S。
　　3. MsZFP基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化
　　通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將MsZFP基因轉(zhuǎn)入煙草,獲得43株P(guān)PT抗性植株。對(duì)植株基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，獲得25株陽(yáng)性植株。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)陽(yáng)性植株基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表

4、明，轉(zhuǎn)基因株系OX3、OX15、OX23中MsZFP的表達(dá)量比較高。
　　4.對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性分析
　　將野生型（WT）和轉(zhuǎn)基因煙草置于-4℃處理2 h，觀察到WT葉片明顯萎蔫，其相對(duì)電導(dǎo)率明顯高于轉(zhuǎn)基因煙草。在0℃低溫脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量明顯低于WT，脯氨酸、可溶性蛋白含量明顯高于WT。表明MsZFP基因可以提高植物的耐寒能力。
　　將WT和轉(zhuǎn)基因煙草相同部位葉圓片浸泡于300 mM NaCl溶液，