低強度超聲對體外骨關節(jié)炎狀態(tài)下的顳下頜關節(jié)軟骨細胞的保護作用.pdf

1、目的:
　　本實驗的目的是探究低強度超聲作用于體外白介素1β因子刺激下大鼠顳下頜軟骨細胞中Wnt/β-catenin信號通路的變化，以及LIPUS對顳下頜軟骨細胞的骨保護作用。
　　方法:
　　取4周齡Wistar大鼠髁突軟骨細胞，于體外培養(yǎng)。在無菌的條件下，取雙側髁突組織，用含有雙抗的PBS，沖洗、剝離髁突軟骨，反復剪切至1mm3大小，首先在37℃環(huán)境下用0.25％濃度的胰蛋白酶消化30分鐘，然后37℃振蕩加入濃度為

2、0.2％的Ⅱ型膠原酶，1-2小時消化完后、分離原代軟骨細胞并培養(yǎng)，原代軟骨細胞生長、形態(tài)變化，通過每天用倒置光學顯微鏡觀測，并用細胞形態(tài)學、Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色、Ⅱ型膠原免疫熒光染色方法，來鑒定培養(yǎng)結果。隨機將髁突軟骨細胞第二代分為四組，分別用0、1、5、10ng/ml IL-1β處理48小時，對各組之間Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、DKK1、Ⅱ型膠原、AGG蛋白和mRNA表達量進行檢測，并篩選出能造成

3、髁突軟骨細胞炎性狀態(tài)的IL-1β最佳濃度和檢測IL-1β改變對于Wnt/β-catenin通路的不同影響;取已鑒定的髁突軟骨細胞P2隨機分為五組:對照組，細胞不做任何處理;IL-1β組，10ng/ml IL-1β處理48小時;LIPUS組，10ng/ml IL-1β處理48小時后LIPUS每天處理20分鐘，共七天?？瞻踪|粒+LIPUS組:10ng/ml IL-1β處理48小時，提前48小時加入空載質粒后LIPUS每天處理20分鐘，共七天

4、。siRNA+LIPUS組:10ng/ml IL-1β處理48小時，提前48小時加入DKK1干擾質粒siRNA后LIPUS每天處理20分鐘，共七天。分別用western blotting檢測各組之間Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、DKK1、Ⅱ型膠原、AGG的蛋白表達量;qRT-PCR檢測各組Wnt3a、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、DKK1、Ⅱ型膠原、AGG mRNA表達量;倒置熒光顯微鏡觀

5、測siRNA對于軟骨細胞的轉染情況。
　　結果:
　　(1)消化髁突，提取軟骨細胞接種，觀察見細胞呈形態(tài)規(guī)則、小圓形。一天后，細胞多數貼壁，鏡下觀察可呈多邊形或者星形;5天后，可觀察到“鋪路石”樣。經一次傳代后，細胞貼壁的速度明顯變快，勻稱分布;據我們觀察在4代以內，軟骨細胞增殖速率較快。在此以后，髁突軟骨細胞呈長梭形，出現“去極化”現象，生長速度加快。胞漿內可見有棕黃色顆粒和紅色熒光顆粒，通過Ⅱ型膠原免疫細胞化學和細胞免疫

6、熒光染色發(fā)現。(2)10ng/ml IL-1β降低髁突軟骨細胞Ⅱ型膠原和AGG表達的效果最明顯，對于Wnt/β-catenin通路有顯著促進作用，同時DKK1表達升高。(3)低強度超聲干預炎性髁突軟骨細胞后，collagenⅡ、AGG表達水平明顯升高，Wnt3a、β-catenin、GSK3β下降，DKK1表達升高;低強度超聲干預并加入DKK1干擾RNA后，DKK1，collagenⅡ、AGG表達水平下降，Wnt3a、β-catenin