長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000434223抑制非小細(xì)胞肺癌的機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　非小細(xì)胞肺癌包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌，是所有癌癥中最常見(jiàn)的類(lèi)型，也是全世界癌癥相關(guān)死亡的最主要原因之一。由于非小細(xì)胞肺癌的早期通常沒(méi)有癥狀，大部分患者在疾病晚期才被確診。近年來(lái)，盡管外科手術(shù)和放化療治療方法已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，肺癌的預(yù)后仍然令人沮喪，其5年生存率只有15％。因此，揭示非小細(xì)胞肺癌發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的非小細(xì)胞肺癌的診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)尤為重要，也是肺癌研究領(lǐng)域的難點(diǎn)。
　　最近的一項(xiàng)研究用微

2、陣列的方法檢測(cè)了人肺腺癌樣品中特異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000434223在早期肺腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，但是對(duì)于其在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的功能和機(jī)制仍知之甚少。本課題擬分三個(gè)部分，揭示ENST00000434223與患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性及其調(diào)控非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，運(yùn)用過(guò)表達(dá)及 siRNA敲低技術(shù)研究ENST00000434223對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的調(diào)控，并研究其對(duì)腫

3、瘤細(xì)胞周期、凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變的影響，探討ENST00000434223作為非小細(xì)胞肺癌潛在的早期診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的可能性。
　　第一部分長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000434223表達(dá)譜研究及其表達(dá)水平和臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性分析
　　目的：
　　比較正常支氣管上皮細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中長(zhǎng)鏈非編碼 RNA ENST00000434223的表達(dá)水平，以及56對(duì)人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌與其匹配的相鄰非癌組織中 ENS

4、T00000434223的表達(dá)水平，并分析 ENST00000434223的表達(dá)水平與56位非小細(xì)胞肺癌病人的各項(xiàng)臨床特征的相關(guān)性，探討其作為非小細(xì)胞肺癌的早期診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的可能性。
　　方法：
　　用TRIzol法抽取正常支氣管上皮細(xì)胞及各非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用Real time-PCR比較兩者中ENST00000434223的表達(dá)水平；用TRIzol法抽取56對(duì)人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌及與其匹

5、配的相鄰非癌組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用Real time-PCR比較兩者中ENST00000434223的表達(dá)水平，并分析 ENST00000434223的表達(dá)水平與56位非小細(xì)胞肺癌病人的各項(xiàng)臨床特征的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　細(xì)胞系Real time-PCR結(jié)果顯示，與正常支氣管上皮細(xì)胞系（16HBE）相比，長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000434223在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,SK-MES-1，SPC

6、-A1和NCI-H1975中的表達(dá)水平均下調(diào)，其中，ENST00000434223在A549細(xì)胞中表達(dá)最高，在NCI-H1975細(xì)胞中表達(dá)最低。
　　組織Real time-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與匹配的相鄰正常組織相比，ENST00000434223在癌組織的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.01），且低ENST00000434223表達(dá)水平與腫瘤直徑（P<0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.05），TNM分期（P<0.05）相關(guān)，但與其他因素，例

7、如年齡、性別和腫瘤分化不相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000434223在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和非小細(xì)胞肺癌組織中均下調(diào)；長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000434223的低表達(dá)與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期正相關(guān)，與年齡、性別及腫瘤分化無(wú)關(guān)。
　　第二部分長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000434223抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)機(jī)制研究
　　目的：
　　確定長(zhǎng)鏈非編碼RNA

8、 ENST00000434223對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的影響，并確定其是否通過(guò)調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞周期和凋亡來(lái)影響肺癌細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)。
　　方法：
　　用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和siRNA技術(shù)過(guò)表達(dá)或敲低 ENST00000434223，再用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒檢測(cè)其對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控，并用免疫印跡的方法確定其對(duì)增殖細(xì)胞核內(nèi)抗原 PCNA蛋白水平的影響，然后再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲低ENST00000434223對(duì)細(xì)胞周

9、期的調(diào)控，用免疫印跡確定其對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控因子p21蛋白水平的影響，最后用PI染色的方法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。另外，我們還建立了裸鼠異種移植模型，在裸鼠體內(nèi)研究過(guò)表達(dá)ENST00000434223對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　結(jié)果：
　　H1975細(xì)胞的細(xì)胞存活率隨著ENST00000434223的過(guò)表達(dá)而減少，而A549細(xì)胞的存活率隨著 ENST00000434223的敲低而相應(yīng)增加。與此相符，ENST00000434223

10、過(guò)表達(dá)的H1975細(xì)胞中細(xì)胞核抗原（PCNA）的蛋白水平降低了60%左右，ENST00000434223敲低的A549細(xì)胞中細(xì)胞核抗原（PCNA）的蛋白水平是對(duì)照細(xì)胞中的3倍。
　　流式細(xì)胞分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ENST00000434223過(guò)表達(dá)誘發(fā)了H1975細(xì)胞在G0/G1期的阻滯，而敲低ENST00000434223則降低了A549細(xì)胞在G0/ G1期的細(xì)胞所占百分比。與這些結(jié)果相一致，免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)ENST0000043422

11、3在H1975細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，p21蛋白水平提高為對(duì)照細(xì)胞的2倍，在A549細(xì)胞中敲低ENST00000434223表達(dá)后，p21蛋白水平則下降了60%左右。
　　為了進(jìn)一步確定ENST00000434223抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的功能是否通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了當(dāng)ENST00000434223在H1975細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ENST00000434223過(guò)表達(dá)顯著增加了H1975細(xì)胞的凋亡（

12、3-4倍）。
　　與體外實(shí)驗(yàn)相一致，裸鼠異種移植模型實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá) ENST00000434223的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)顯著降低。
　　結(jié)論：
　　ENST00000434223的過(guò)表達(dá)降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975細(xì)胞的存活率和該細(xì)胞中細(xì)胞核抗原（PCNA）的蛋白水平；敲低 ENST00000434223的表達(dá)增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的存活率和該細(xì)胞中細(xì)胞核抗原（PCNA）的蛋白水平；ENST00

13、000434223過(guò)表達(dá)誘發(fā)了H1975細(xì)胞在G0/ G1期的細(xì)胞阻滯，并上調(diào)p21蛋白水平；敲低ENST00000434223則降低了A549細(xì)胞在G0/ G1期的細(xì)胞所占百分比及 p21蛋白水平；ENST00000434223過(guò)表達(dá)顯著增加了H1975細(xì)胞的凋亡3-4倍。過(guò)表達(dá)ENST00000434223的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)顯著降低，且其Ki67的陽(yáng)性率降低。這些結(jié)果表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST0000

14、0434223可以通過(guò)誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的G0/G1阻滯及凋亡來(lái)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。
　　第三部分長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000434223抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲機(jī)制研究
　　目的：
　　確定長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000434223對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的影響，并確定其是否通過(guò)調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變來(lái)影響肺癌細(xì)胞侵襲。
　　方法：
　　用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和si

15、RNA技術(shù)過(guò)表達(dá)或敲低長(zhǎng)鏈非編碼 RNA ENST00000434223，再檢測(cè)其對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的調(diào)控。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）已經(jīng)被證明可促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，接下來(lái)我們用免疫組化及免疫印跡的方法檢測(cè)過(guò)表達(dá) ENST00000434223對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變的影響，確定ENST00000434223是否通過(guò)調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變來(lái)影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。
　　結(jié)果：
　　遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

16、明，過(guò)表達(dá)ENST00000434223顯著降低了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975的遷移和侵襲的能力，而敲低ENST00000434223則顯著增加了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的遷移和侵襲的能力。
　　免疫熒光分析表明，ENST00000434223過(guò)表達(dá)的H1975細(xì)胞擁有更全面的上皮細(xì)胞形態(tài)，ENST00000434223過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了E-鈣粘蛋白水平顯著增加，以及 N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)的顯著降低。免疫印跡分析證實(shí)了免疫熒光分析的

17、結(jié)果：其中E-鈣粘蛋白水平是對(duì)照細(xì)胞的4倍，而N-鈣粘蛋白和波形蛋白的水平則分別為對(duì)照細(xì)胞的13%和19%。
　　結(jié)論：
　　ENST00000434223可以顯著降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975的遷移和侵襲的能力；ENST00000434223過(guò)表達(dá)的H1975細(xì)胞擁有更全面的上皮細(xì)胞形態(tài)；ENST00000434223抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變。這些結(jié)果表明，ENST00000434223可以通過(guò)抑制非小細(xì)胞肺癌