HMGA2-FOXL2通路調(diào)控多藥耐藥胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化及侵襲轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、【背景】胃癌嚴重危害國人健康，其發(fā)病率高，死亡率高，預(yù)后較差。化療是胃癌治療的基礎(chǔ)手段之一，在降低腫瘤負荷方面發(fā)揮著重要作用。在治療的初始階段多數(shù)患者體內(nèi)的胃癌細胞對化療藥物反應(yīng)敏感。然而，隨著治療的進展，腫瘤細胞逐漸發(fā)生多藥耐藥。值得注意的是，發(fā)生多藥耐藥后的胃癌往往進展迅速，在短時間內(nèi)就出現(xiàn)局部侵犯和全身廣泛轉(zhuǎn)移，提示胃癌耐藥與轉(zhuǎn)移之間存在密切關(guān)系。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）是腫瘤細胞惡性進展的重要驅(qū)動因素。近年來的研究表

2、明，EMT作為啟動腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟與腫瘤細胞的耐藥有著十分密切的關(guān)系，表現(xiàn)為：腫瘤細胞發(fā)生EMT后可對多種化療藥物產(chǎn)生耐受，而化療耐藥的腫瘤細胞也常常具有EMT的特征。因此，深入探索耐藥細胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵機制，尋找可以逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細胞EMT的靶點可為抑制胃癌多藥耐藥細胞的侵襲轉(zhuǎn)移和改善患者預(yù)后提供新的思路。
　　【目的】
　　1.明確EMT在胃癌耐藥細胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　2.篩選并驗證調(diào)控胃癌耐藥細胞EM

3、T的關(guān)鍵分子并明確其作用機制。
　　3.明確調(diào)控胃癌細胞EMT的分子在胃癌組織中表達的臨床意義。
　　【方法】
　　1.利用 Transwell實驗和裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移實驗比較胃癌耐藥細胞和親本細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的差別；利用實時熒光定量 PCR（ quantitative Real-time PCR, qRT-PCR）技術(shù)、western blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測胃癌耐藥和親本細胞中EMT標志物的變化；采用 cD

4、NA芯片結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法篩選參與調(diào)控胃癌耐藥細胞 EMT的關(guān)鍵分子；采用免疫組化檢測候選分子與 EMT標志物E-cadherin在胃癌組織中的表達，并統(tǒng)計分析其相關(guān)性。
　　2.合成針對HMGA2和FOXL2的小干擾RNA（siRNA）,構(gòu)建HMGA2和FOXL2的過表達和shRNA干擾載體，分別通過瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染構(gòu)建HMGA2和FOXL2的功能缺失和功能獲得細胞模型。分別采用Transwell和原位移植瘤轉(zhuǎn)移模型實驗評價

5、細胞的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力，采用 western blot和qRT-PCR技術(shù)檢測EMT標志物的變化。采用western blot技術(shù)檢測化療藥物處理后HMGA2和FOXL2表達的變化。
　　3.干預(yù) HMGA2和 FOXL2表達后，采用 western blot和 qRT-PCR分別從蛋白和mRNA水平檢測相關(guān)分子表達；采用Transwell和原位移植瘤模型檢測細胞體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　4.采用瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建功

6、能獲得和功能缺失細胞模型；采用western blot和qRT-PCR分別從蛋白和mRNA水平檢測相關(guān)分子表達；采用Luciferase報告基因檢測E2F1對FOXL2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；采用免疫共沉淀技術(shù)聯(lián)合western blot檢測蛋白相互作用。
　　5.采用cDNA芯片篩選FOXL2下游靶基因；在FOXL2功能獲得和功能缺失的細胞里采用western blot和qRT-PCR檢測ITGA2表達；在ITGA2功能獲得和功能缺失的細胞

7、里采用qRT-PCR、western blot和免疫熒光檢測EMT標志物的變化，采用Transwell和裸鼠原位移植瘤模型檢測細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力變化。
　　6.采用免疫組化在胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織中檢測HMGA2、FOXL2和ITGA2的表達，并統(tǒng)計分析其表達水平在原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶中差別及其表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系。
　　【結(jié)果】
　　1. Transwell和尾靜脈注射轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果表明胃癌耐藥細胞的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力較親

8、本細胞顯著增強。qRT-PCR和western blot檢測發(fā)現(xiàn)耐藥細胞與親本細胞相比E-cadherin表達下降，Vimentin表達升高，表明耐藥細胞發(fā)生了EMT。通過基因芯片篩查我們獲得了423個在耐藥細胞中表達升高2倍以上的候選基因，通過生物信息學(xué)分析鎖定了8個與基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的候選分子，通過查閱Kaplan-Meier Plot網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)其中4個基因表達升高與胃癌預(yù)后差相關(guān)。最后，通過對胃癌組織進行免疫組化染色發(fā)現(xiàn) HMGA2和

9、FOXL2表達與上皮標志物E-cadherin表達呈負相關(guān)。
　　2.在耐藥細胞中分別下調(diào)HMGA2和FOXL2顯著抑制細胞的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力，并促進上皮標志物E-cadherin的表達，抑制間質(zhì)標志物Vimentin的表達；在親本細胞中分別過表達HMGA2和FOXL2則抑制E-cadherin表達，促進Vimentin表達并促進細胞的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移，表明HMGA2和FOXL2通過誘導(dǎo)EMT調(diào)控了胃癌耐藥細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。同時，發(fā)

10、現(xiàn)短時間化療藥物處理能使胃癌細胞中HMGA2和FOXL2表達升高，表明兩者可被化療藥物誘導(dǎo)表達。
　　3.內(nèi)源性HMGA2和FOXL2在多種胃癌細胞系中表達水平不同，但干預(yù)HMGA2的表達均可引起FOXL2發(fā)生同向表達變化。同時，我們發(fā)現(xiàn)抑制FOXL2可阻斷HMGA2對胃癌耐藥細胞侵襲轉(zhuǎn)移和EMT的調(diào)控作用，提示HMGA2可能通過影響FOXL2發(fā)揮功能。
　　4. qRT-PCR結(jié)果表明E2F1經(jīng)典下游靶基因在耐藥細胞中表達

11、升高，提示耐藥細胞中E2F1轉(zhuǎn)錄活性增強；在耐藥和親本細胞中干預(yù)E2F1表達可以引起FOXL2同向變化，表明 FOXL2表達受 E2F1調(diào)控；啟動子 Luciferase報告基因結(jié)果顯示FOXL2啟動子區(qū)域存在E2F1的結(jié)合位點；免疫共沉淀及Luciferase報告基因結(jié)果表明HMGA2與pRb相互作用可以促進E2F1對FOXL2的轉(zhuǎn)錄。
　　5.基因芯片篩選結(jié)果表明 ITGA2是 FOXL2潛在的下游基因；在耐藥細胞下調(diào)FOXL

12、2可以導(dǎo)致ITGA2表達下降，提示ITGA2的表達受FOXL2的調(diào)控；在耐藥細胞中下調(diào) ITGA2顯著抑制細胞的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力，并導(dǎo)致 E-cadherin表達升高，Vimentin表達降低；在親本細胞中過表達ITGA2則促進細胞的侵襲轉(zhuǎn)移、抑制E-cadherin表達、促進Vimentin表達，表明ITGA2同可以通過調(diào)控EMT促進胃癌耐藥細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。同時，我們發(fā)現(xiàn)ITGA2可以拮抗FOXL2的促EMT作用。
　　6.免

13、疫組化染色結(jié)果表明HMGA2、FOXL2和ITGA2在胃癌淋巴結(jié)和其他轉(zhuǎn)移灶中的表達水平顯著高于原發(fā)灶的水平，而且轉(zhuǎn)移癌中HMGA2、FOXL2和ITGA2的表達高于非轉(zhuǎn)移癌，提示HMGA2、FOXL2和ITGA2高表達與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。通過對HMGA2、FOXL2和ITGA2的表達與胃癌患者生存情況進行分析，發(fā)現(xiàn)三個分子中任意一個分子高表達都與胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)，且其中任意兩個分子組合的預(yù)測效果優(yōu)于單一分子預(yù)測效果。
　　【結(jié)論

14、】本課題闡明了一條新的促進胃癌耐藥細胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移的信號通路。在化療藥物的作用下，HMGA2表達升高并通過與pRb相互作用促進E2F1對FOXL2的表達，后者進一步通過促進 ITGA2的表達從而導(dǎo)致胃癌細胞發(fā)生 EMT和侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強。通過臨床標本驗證，我們發(fā)現(xiàn)HMGA2、FOXL2和ITGA2高表達與胃癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)。綜上所述，本課題為認識胃癌耐藥和轉(zhuǎn)移的內(nèi)在聯(lián)系提供了理論基礎(chǔ)，為開發(fā)同時靶向胃癌耐藥和轉(zhuǎn)移的治療策略提供