兒童耐多藥結(jié)核桿菌差異表達基因的篩選及克隆.pdf

1、目的：本研究擬避開傳統(tǒng)在已知結(jié)核菌耐藥相關(guān)基因中一一進行探索的實驗方法，直接從基因差異表達角度入手，就可能參與調(diào)控結(jié)核菌耐多藥性產(chǎn)生的基因進行一次橫向、大范圍的篩選；了解兒童結(jié)核桿菌耐多藥調(diào)節(jié)機制與成人的異同點。
　　方法：收集我院感染消化科從2003年7月～2010.12月所有培養(yǎng)陽性的結(jié)核菌株，在已進行耐藥鑒定和基因分型的基礎(chǔ)上，以耐多藥菌株cDNA為實驗組(Tester)，敏感株cDNA為驅(qū)動組(Driver)，應用抑制消減

2、雜交(SSH)技術(shù)結(jié)合T/A克隆技術(shù)構(gòu)建族耐多藥與敏感菌株差異表達消減cDNA文庫，利用Blastn軟件將所獲得的表達序列標簽(EST)序列與公共數(shù)據(jù)庫GenBank進行同源性分析。
　　結(jié)果：經(jīng)過兩次消減雜交及PCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)“A/T clone”克隆到PMD-18T載體，轉(zhuǎn)染至感受態(tài)大腸桿菌DH5，所長出的菌落中約90％為白色菌落，成功構(gòu)建耐多藥結(jié)核桿菌cDNA消減文庫。經(jīng)PCR鑒定約80％有特異性擴增帶且擴增帶分子量在2

3、00～1000bp之間，陽性率較高。隨即挑選248個陽性克隆進行基因測序，經(jīng)同源性分析去除無效及重復序列，共獲得113個差異表達cDNA片段，其中有5條未知EST序列，其余108個均為已知基因(5個參與結(jié)核耐藥的形成)，其主要功能分類主要為：①細胞壁及相關(guān)過程蛋白基因，如Rv0987，Rv3783，Rv2318；②PPE家族蛋白相關(guān)基因，如Rv3343c PPE54，Rv1918c PPE35；③參與中間代謝和呼吸活動相關(guān)基因，如Rv3

4、858c Rv3784，Rv3068c；④與結(jié)核桿菌毒力，解毒作用及其適應性相關(guān)基因，如Rv2477cRv0783c Rv2303c；⑤細菌脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，如Rv2933 Rv2931Rv3515c；⑥調(diào)控相關(guān)蛋白，如Rv3765c Rv2799c Rv0984；⑦假想蛋白，如Rv1498A Rv2603 Rv0690c及一些信號通路、調(diào)節(jié)蛋白和插入序列等。
　　結(jié)論：研究表明SSH技術(shù)是篩選差異表達基因和新功能基因的有效方法；