慢病毒介導(dǎo)人CCL21基因轉(zhuǎn)染對胰腺癌細(xì)胞(PANC-1)作用的實驗研究.pdf

1、胰腺癌(pancreas cancer)是惡性程度較高的腫瘤之一,其發(fā)病率呈上升趨勢。大多數(shù)胰腺癌患者出現(xiàn)癥狀就診時已屬中晚期,即使手術(shù)治療,預(yù)后亦較差,且其具有周圍血管浸潤和嗜神經(jīng)生長特性,早期診斷率較低,易于轉(zhuǎn)移,其分化程度和淋巴轉(zhuǎn)移直接影響患者的預(yù)后,因此,對于深入研究胰腺癌的治療意義重大。
　　 趨化因子(chemokine)是一類結(jié)構(gòu)同源、功能相似的細(xì)胞因子超家族,其作用是啟動并調(diào)節(jié)特異性細(xì)胞在體內(nèi)遷移與定位,其中部分

2、細(xì)胞正是機(jī)體抗腫瘤免疫的效應(yīng)細(xì)胞。次級淋巴組織趨化因子(secondary lymphoid tissue chemokine,SLC)屬于CC亞族趨化因子,即CCL21,通過趨化、介導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答,發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng),但其又具有雙向效應(yīng),可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌蛋白水解酶,加快腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。
　　 慢病毒(Lentivirus)載體是一類重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體,由慢病毒經(jīng)過改造而成,具有更高的生物安全性

3、和外源基因的表達(dá)效率,它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力,并可以在體內(nèi)較穩(wěn)定的表達(dá),其感染目的細(xì)胞后不會再感染其他細(xì)胞,也不會利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒,安全性好。慢病毒載體是目前基因治療中研究較多的載體。
　　 目的:
　　 本課題研究通過克隆人的CCL21基因,構(gòu)建pEASY-T1 simple-CCL21質(zhì)粒,經(jīng)序列測定后進(jìn)一步構(gòu)建人CCL21基因慢病毒表達(dá)載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Real-time PCR篩選出的高表

4、達(dá)CCR7的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1,觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化,進(jìn)一步通過PCR基因芯片檢測目的基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)信號通路中某些基因的變化,探討人CCL21基因轉(zhuǎn)染對胰腺癌的作用。
　　 方法:
　　 1.利用基因克隆技術(shù)克隆出人CCL21基因,連接在pEASY-T1 simple cloningvector上,構(gòu)建成pEASY-T1 simple-CCL21質(zhì)粒,再進(jìn)行序列測定;
　　 2.利用基因重組技術(shù)將人C

5、CL21基因連接慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EFI-copGFP,進(jìn)行病毒包裝,滴度測定后濃縮純化;
　　 3.利用Real-time PCR從培養(yǎng)的5種人胰腺癌細(xì)胞株(AsPC-1,BxPC-3,CFPAC-1,PANC-1,SW1990)中篩選出高表達(dá)CCR7的細(xì)胞株;
　　 4.通過慢病毒轉(zhuǎn)染預(yù)實驗確定MOI,進(jìn)行人CCL21重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞株,分為陽性實驗組、陰性對照組、空白對照組,利用

6、PCR、Western blot技術(shù)進(jìn)行驗證,觀察轉(zhuǎn)染后PANC-1細(xì)胞株生物學(xué)行為的變化。
　　 5.采用RT2profilerTMPCR芯片檢測與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、凋亡、黏附、細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)因子的84個基因,深入分析基因變化趨勢,Westem blot驗證,探討人CCL21基因?qū)ANC-1細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　 實驗結(jié)果均采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗和單因素方差分析,以P＜0.05為

7、差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.克隆出人CCL21基因,成功構(gòu)建pEASY-T1 simple-CCL21質(zhì)粒,測序結(jié)果顯示與人類基因庫中CCL21基因序列完全一致;
　　 2.成功構(gòu)建慢病毒載體質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EFI-copGFP-CCL21,經(jīng)病毒包裝后得到攜帶hCCL21的成熟的重組慢病毒顆粒Lenti-hCCL21,濃縮后病毒滴度達(dá)到1.25×108TU/ml;
　　 3

8、.從5種人胰腺癌細(xì)胞株(AsPC-1,BxPC-3,CFPAC-1,PANC-1,SW1990)中篩選出高表達(dá)CCR7的細(xì)胞株P(guān)ANC-1;
　　 4.重組慢病毒顆粒Lenti-hCCL21成功轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1,并穩(wěn)定表達(dá),但PANC-1細(xì)胞生物學(xué)行為無明顯變化;
　　 5.通過RT2ProfilerTMPCR芯片篩選出8個明顯變化基因,其中上調(diào)基因2個,分別為:ATM,BRCA1;下調(diào)基因6個,分別為:AK

9、T1,CASP8,FOS,IL8,ITGA2,JUN;根據(jù)基因功能不同分類,其中與凋亡有關(guān)基因為CASP8;與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄有關(guān)基因為AKT1,FOS,FUN;與細(xì)胞周期有關(guān)基因為ATM,BRCA1;與血管生成有關(guān)基因為IL8;與粘附作用有關(guān)基因為ITGA2;此外,MMP-9基因變化低于2倍,陽性實驗組比空白對照組、陰性對照組分別上調(diào)1.40倍,1-31倍,而TIMP1基因陽性實驗組比空白對照組、陰性對照組分別下調(diào)1.01倍,1.02倍

10、,Western blot檢測結(jié)果顯示陽性實驗組MMP-9的表達(dá)量比陰性對照、空白對照組增加。
　　 結(jié)論:
　　 本課題研究,利用基因克隆技術(shù)成功克隆出人CCL21基因,采用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建CCL21重組慢病毒載體,包裝成熟的重組慢病毒顆粒Lenti-hCCL21穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達(dá)CCR7的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1,但轉(zhuǎn)染后的PANC-1細(xì)胞其生物學(xué)行為未發(fā)生明顯變化,進(jìn)一步通過RT2profilerTMPCR芯片篩選