環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌的研究.pdf

1、食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來食品安全問題的一個顯著特點，產(chǎn)毒素性大腸桿菌導致的腹瀉是公共衛(wèi)生學上具有重要意義的人畜共患病之一。為確保食品安全與食品貿易，需要大力加強食品檢驗的力度，迫切需要建立快速、靈敏的產(chǎn)毒素性大腸桿菌的檢驗方法。環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用4條特殊設計的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地擴增DNA的新技

2、術。該技術以其特異性強、靈敏度高、快速、準確和操作簡便等優(yōu)點在核酸的科學研究、疾病的診斷和轉基因食品檢測等領域得到了日益廣泛的應用。
　　 本課題采用LAMP技術檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)，靈敏度高，特異性強，檢測方法簡便，耗時短且檢測成本低。針對產(chǎn)毒素性大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat labile enterotoxin, LT)基因保守序列為靶序列運用在

3、線引物設計軟件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)設計LAMP引物，同時驗證了引物的特異性及可行性。建立了檢測ETEC不耐熱腸毒素基因的LAMP方法。對反應時間、反應溫度、鎂離子濃度等擴增條件進行優(yōu)化，確定25μL的LAMP反應體系為：內引物（FIP和BIP）各1.2μM，外引物（F3和B3）各0.2μM，0.5mMdNTP，4mMMgCl2，10×BstDNA聚合酶反應緩沖液

4、，7.2U的BstDNA聚合酶大片段，2μLDNA模板和用滅菌雙蒸水補足體系。LAMP反應過程是首先在62℃水浴鍋中反應30min，然后將其放入80℃水浴鍋中，水浴3min終止反應，通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀，即可判斷是否發(fā)生了LAMP反應。此外，取擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，觀察梯形條帶，以證實是否發(fā)生了LAMP反應。
　　 為了比較LAMP檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌的靈敏度和人工污染檢出限，以PCR方法作對照。結果表明，

5、LAMP檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌的檢出限為32.9CFU/mL，人工污染的生豬肉的檢出限為55CFU/g。采用試劑盒提取DNA，從樣品處理到報告結果，耗時1h。對照PCR耗時3h，檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌的檢出限為3.29×104CFU/mL，人工污染產(chǎn)毒素性大腸桿菌的生豬肉的檢出限為5.5×104CFU/g。LAMP的靈敏度是PCR的1000倍。
　　 通過對實際樣品進行檢測，確定LAMP方法敏感性為100％，特異性為70％，符合率為