Tspan1、Tspan8在胰腺癌中的表達及其功能研究.pdf

1、前言
　　胰腺癌是腫瘤相關性疾病中死亡率最高的癌腫之一，胰腺癌患者預后差，國內外多個醫(yī)療中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，1年生存率在20％以下，5年生存率低于5％。低生存率原因在于80％以上的病人在確診時已經(jīng)廣泛轉移，大部分病人死于癌腫轉移及浸潤。胰腺導管腺癌(PDAC)是胰腺癌中最常見的病理類型，約占胰腺癌的80％-90％。胰腺癌的惡性行為以腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離、移動、種植并浸潤生長形成轉移灶或復發(fā)灶為特征。胰腺癌早期即可能發(fā)生淋巴、腹腔、肝

2、臟等部位的轉移。目前治療方法，無論是根治性手術或是化療，均不能顯著提高生存率。對胰腺癌轉移及浸潤行為的機制研究，一直是熱點。以降低復發(fā)率及死亡率為目標的對有效靶向治療的探索，是目前研究的出發(fā)點。四跨膜蛋白超家族(TM4SF)是特殊的細胞膜糖蛋白。Tspan1及Tspan8作為TM4SF家族中的成員，在胃癌、結腸癌、肝癌及食道癌中均為高表達，與淋巴結轉移、腫瘤復發(fā)及轉移等臨床特征呈正相關性。但在胰腺癌中，目前沒有相關研究。Tspan1與T

3、span8復合體的形成會增加腫瘤細胞的遷徙性及浸潤性。對Tspan1及Tspan8在胰腺癌中的惡性行為及機制的研究可能對于胰腺癌的預測、診斷、預后評估、靶向治療具有重大的臨床意義。
　　目的
　　本研究目的在于分析Tspan1及Tspan8在PDAC中表達與臨床特征的關系，評價其對PDAC預后的預測價值，并下調Tspan1基因表達，觀察其在胰腺癌細胞中的生物學行為，探討其可能機制，為胰腺癌的診斷、治療及預后分析提供新的標志物

4、及靶向治療目標。
　　研究方法
　　一、實驗材料
　　1、胰腺導管腺癌(PDAC)組織石蠟切片95例及癌旁正常胰腺組織石蠟切片55例，來自外科手術切除蠟塊，并進行組織切片對應病例臨床資料采集。
　　2、胰腺癌細胞株BxPC-3、HPAF-Ⅱ、Capan1、Capan2購自中國中科院上海細胞庫。所有細胞采用貼壁細胞法培養(yǎng)、傳代及保留。
　　二、實驗方法
　　1、免疫組織化學(IHC)檢測PDAC及癌旁正

5、常組織中Tspan1及Tspan8表達，探討其表達的臨床病理學意義，進行生存分析，繪制生存曲線，并分析其對PDAC預后的判斷價值。
　　2、qRT-PCR及Western印跡方法檢測胰腺癌細胞株（BxPC-3、HPAF-Ⅱ、Capan1、Capan2）中Tspan1在mRNA及蛋白水平表達，篩選出表達量最高的胰腺癌細胞株進行下一步試驗。
　　3、siTspan1轉染Bx-PC3，沉默Tspan1，通過qRT-PCR及West

6、er印跡法檢測沉默效率。
　　4、MTT法檢測Tspan1下調后胰腺癌細胞的增值變化;Transwell法檢測Tspan1下調后胰腺癌細胞遷徙及浸潤能力變化;流式細胞檢測Tspan1下調后胰腺癌細胞凋亡情況。
　　研究結果
　　一、Tspan1、Tspan8在人胰腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系
　　1、Tspan1和Tspan8表達集中于PDAC導管細胞膜，在癌旁組織中Tspan1、Tspan8無表達或

7、輕度表達，二者對比有統(tǒng)計學差異(x2=7.429，P＜0.05;x2=15.1，P＜0.01)。
　　2、Tspan1高表達與淋巴結轉移、腫瘤TNM分期有正相關性（x2=6.688，P＜0.01;x2=13.055，P＜0.01）;Tspan8高表達與腫瘤TNM分期呈正相關性（x2=8.896，P＜0.05）。
　　3、Spearmanrank相關分析結果顯示Tspan1及Tspan8有統(tǒng)計學正相關性(r=0.223，P＜0

8、.05)。
　　4、Tspan1與PDAC的復發(fā)率呈正相關性(x2=6.116，P＜0.05)。
　　5、Tspan1及Tspan8高表達與生存期呈負相關(P＜0.01;P＜0.05);Tspan1及Tspan8表達水平可作為PDAC預后獨立預測因素(P＜0.01;P＜0.05)。
　　二、Tspan1在胰腺細胞中表達，下調Tspan1基因表達對胰腺癌細胞株(Bx-PC3)增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響
　　1、q

9、RT-PCR結果顯示，Tspan1在BxPC-3、HPAF-Ⅱ、Capan1、Capan2細胞系中mRNA水平均有表達，Bx-PC3表達量最高。
　　2、Western印跡檢測顯示，Tspan1在BxPC-3、HPAF-Ⅱ、Capan1、Capan2細胞系中蛋白水平均有表達，BxPC-3表達量最高。
　　3、轉染效果檢測
　　(1)qRT-PCR.:
　　siTspan1轉染后，胰腺癌細胞Tspan1在mRNA水

10、平表達量明顯降低，干擾效果明顯，下調效率約為75％-90％。
　　(2)Western印跡檢測:
　　Western印跡檢測顯示在27kd處有黑灰色條帶顯示，為Tspan1表達，NegativeControl組與Tspan1組條帶濃度基本一致，差異無顯著性（P＞0.05）;siTspan1組Tspan1表達條帶明顯淡于NegativeControl組及Tspan1組，差異有顯著性(P＜0.01)。
　　4、細胞增殖檢測

11、(MTT)
　　MTT檢測siTspan1干擾后胰腺癌細胞株的增殖功能，通過采集0、24、48、72、96、120時間點的數(shù)據(jù)，Negativecontrol組、Tspan1組與siTspan1組比較結果顯示，siTspan1干擾對胰腺癌細胞增殖能力統(tǒng)計學差異無顯著性(P＞0.05;P＞0.05)。
　　5、siRNA轉染后細胞遷移能力檢測
　　Transwell顯示，應用顯微鏡記錄Tspan1、siTspan1及Ne

12、gativecontrol細胞的遷移能力的差異，并對8個不同視野(×100)進行計數(shù)，并重復3次實驗，通過計算得到siTspan1轉染細胞較Negativecontrol轉染細胞及Tspan1細胞遷徙減少百分比，瞬時轉染siTspan1后與Negativecontrol及Tspan1細胞對比，明顯降低細胞的遷徙能力(P＜0.01;P＜0.01)。
　　6、siRNA轉染后細胞侵襲能力檢測
　　BioCoatMatrigeli

13、nvasionchamber進行檢測siRNA轉染前后細胞侵襲能力的變化，應用顯微鏡記錄Tspan1、siTspan1及Negativecontrol細胞的侵襲能力的差異，對8個不同視野(×100)進行計數(shù)，并重復3次實驗，通過計算得到siTspan1轉染細胞較Negativecontrol轉染細胞及Tspan1細胞遷徙減少百分比，如圖，可見瞬時轉染siTspan1后，穿膜細胞數(shù)較少，與Negativecontrol組及Tspan1組對

14、比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05;P＜0.05)，下調Tspan1會明顯降低Bx-PC3細胞的侵襲能力。
　　7、檢測siRNA轉染后對細胞凋亡的影響
　　AnnexinⅤmethod結果顯示，Tspan1、siTspan1、NegativeControl各組凋亡率分別為0.75％、9.56％、0.12％，siTspan1與Negativecontrol及Tspan1組對比，統(tǒng)計學差異有顯著性(P＜0.05;P＜0.05)。下調