黑色素瘤細胞表達的LSECtin抑制抗腫瘤T細胞免疫反應(yīng)并促進小鼠黑色素瘤的生長.pdf

1、因為在黑色素瘤病人腫瘤組織內(nèi)能發(fā)現(xiàn)大量的腫瘤浸潤淋巴細胞，所以黑色素瘤相比較其他類型的腫瘤更具免疫原性。即便如此，針對于黑色素瘤的免疫療法大多會失效，其主要原因是在這些黑色素瘤病人體內(nèi)腫瘤抗原特異性的CD8+T細胞大多失去了應(yīng)有的效應(yīng)功能。目前有很多研究都致力于揭示導(dǎo)致這些腫瘤抗原特異性的CD8+T細胞失去其效應(yīng)功能的內(nèi)在機制。這些機制主要包括:腫瘤細胞破壞抗原提呈細胞的功能;下調(diào)抗原提呈細胞HLA分子的表達;上調(diào)腫瘤微環(huán)境中的抑制型因

2、子，包括IL-6和IL-10等細胞因子;招募更多的抑制型細胞，例如調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）和髓樣起源的抑制型細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)到腫瘤微環(huán)境中。近年來，T細胞免疫反應(yīng)共抑制分子的功能和應(yīng)用研究逐步受到重視。
　　肝臟和淋巴結(jié)竇內(nèi)皮細胞粘附分子(Liver Sinusoidal Endothelial Cell Lectin，LSEC

3、tin)是我們實驗室從肝臟中發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型跨膜C型凝集素受體，前期研究表明其特異的表達在肝臟和淋巴結(jié)中的竇內(nèi)皮細胞。其主要功能包括作為T細胞免疫反應(yīng)的共抑制分子，在肝臟內(nèi)抑制HBV病毒的清除，從而促進肝臟對HBV的耐受。從免疫學的角度看，抗腫瘤免疫反應(yīng)和慢性病毒感染免疫反應(yīng)有許多類似之處，因此，我們想知道LSECtin作為T細胞免疫反應(yīng)的共抑制分子，是否抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)？
　　首先通過檢測包含有7種腫瘤組織RNA芯片中LSECtin

4、的表達，來篩選其中高表達LSECtin的腫瘤類型，我們發(fā)現(xiàn)黑色素瘤病人中LSECtin表達量較高，且大約有30％左右的病人相對于正常人來說，其LSECtin表達量明顯上調(diào)。接下來，我們進一步檢測黑色素瘤病人組織RNA芯片中LSECtin的表達，在共計40例黑色素瘤病人組織中，有大約20例病人組織中LSECtin表達量相對于正常人的表達量明顯上調(diào)。在RNA水平上確認了黑色素瘤病人組織中表達LSECtin之后，我們進一步從蛋白質(zhì)水平，采用免

5、疫組織化學法檢測到黑色素瘤病人組織芯片中也表達LSECtin，同時采用流式分析法檢測到黑色素瘤病人的術(shù)后新鮮黑色素瘤細胞表面也表達LSECtin。至此，我們確認黑色素瘤病人組織的確表達LSECtin。
　　國際上用于研究人黑色素瘤最好的動物模型是給C57BL/6小鼠接種B16細胞，因此我們需要檢測B16細胞中LSECtin的表達情況。我們發(fā)現(xiàn)不論是RNA水平還是蛋白質(zhì)水平，B16細胞中LSECtin的表達量都非常低，但是接種到小鼠

6、體內(nèi)的B16細胞在形成腫瘤之后，其LSECtin表達量明顯上調(diào)，這也就提示我們很可能是腫瘤微環(huán)境會誘導(dǎo)B16細胞上調(diào)LSECtin的表達。通過獲取小鼠黑色素瘤的組織提取物溶液模擬生理性的腫瘤微環(huán)境，我們發(fā)現(xiàn)其的確能夠上調(diào)LSECtin的表達，并且通過相應(yīng)的抗體封閉實驗表明可能是腫瘤微環(huán)境中的IL-6和IL-10介導(dǎo)了這一上調(diào)。并且，外源的重組細胞因子IL-6和IL-10同樣能夠上調(diào)B16細胞LSECtin的表達。
　　在確認B16

7、細胞本底表達LSECtin較低且在體內(nèi)腫瘤微環(huán)境中會被誘導(dǎo)上調(diào)這一現(xiàn)象之后，我們構(gòu)建了相應(yīng)的B16細胞過表達LSECtin的穩(wěn)定株B16-LSECtin及其對照穩(wěn)定株B16-mock。首先，我們確認這兩株細胞在體外的生長能力并無差異。接下來通過給野生型或者LSECtin敲除型的C57BL/6小鼠接種B16-LSECtin或者B16-mock細胞，我們發(fā)現(xiàn)無論是野生型還是LSECtin敲除型的小鼠，接種B16-LSECtin細胞之后，其生

8、長速度明顯快于接種B16-mock細胞的小鼠。為了確認這一現(xiàn)象是否依賴于LSECtin，我們給野生型或者LSECtin敲除型的C57BL/6小鼠接種B16細胞，再同時注射LSECtin的抗體，我們發(fā)現(xiàn)無論是野生型還是LSECtin敲除型的小鼠，接種B16細胞之后，如果注射了LSECtin的抗體，其腫瘤生長速度明顯慢于注射對照抗體的小鼠。這些結(jié)果提示我們B16細胞表達的LSECtin會促進小鼠黑色素瘤的生長。
　　結(jié)合LSECtin

9、的現(xiàn)有功能研究，我們猜想是否腫瘤細胞表達的LSECtin通過抑制T細胞抗腫瘤免疫反應(yīng)來促進小鼠黑色素瘤自身的生長。為了檢驗這一假設(shè)，我們首先對接種B16-LSECtin或者B16-mock細胞的小鼠腫瘤組織進行免疫組織化學分析，發(fā)現(xiàn)二者腫瘤細胞的增殖情況和凋亡情況均無明顯差異，這就提示我們二者腫瘤生長速度的差異與腫瘤細胞自身的生長情況無關(guān)，而可能與機體的T細胞抗腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)。因此，我們采用CD4和CD8分子的抗體，來清除小鼠體內(nèi)的C

10、D4+或者CD8+T細胞，然后再分別接種B16-LSECtin或者B16-mock細胞，我們發(fā)現(xiàn)CD4+或者CD8+T細胞不存在的情況下，LSECtin過表達之后并不能使小鼠黑色素瘤的生長加快，這也就提示我們的確腫瘤細胞表達的LSECtin需要與T細胞相互作用來發(fā)揮其抑制功能，從而間接促進腫瘤自身的生長。
　　為了進一步明確腫瘤細胞表達的LSECtin是如何來抑制T細胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)，我們從兩個方面著手:其一是否會影響T細胞的增

11、殖，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)T細胞數(shù)目減少？其二是否會直接影響T細胞的效應(yīng)功能？通過分離檢測小鼠腫瘤浸潤淋巴細胞中各種類型T細胞的比例，我們發(fā)現(xiàn)接種B16-LSECtin細胞的小鼠，其腫瘤浸潤淋巴細胞中CD3+和CD8+T細胞的比例明顯低于接種B16-mock細胞的小鼠。通過相應(yīng)的體外共培養(yǎng)實驗，也表明LSECtin能夠抑制CD8+T細胞的增殖，但是不影響其凋亡。接下來，我們先給野生型C57BL/6小鼠接種B16-LSECtin和B16-mock細胞

12、，再分離其腫瘤引流淋巴結(jié)細胞以及脾臟細胞，分別使用IFN-γ胞內(nèi)細胞因子染色法(ICS)和酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)檢測這些細胞的效應(yīng)功能。我們發(fā)現(xiàn)小鼠接種B16-LSECtin細胞之后，其腫瘤引流淋巴結(jié)細胞以及脾臟細胞的效應(yīng)功能明顯減弱。另一方面，我們采用體外共培養(yǎng)的實驗體系，也表明腫瘤細胞表達的LSECtin能夠抑制CD8+T細胞IFN-γ的釋放。這些數(shù)據(jù)提示我們腫瘤細胞表達的LSECtin不僅可以抑制T細胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)

13、T細胞數(shù)目減少，還能直接削弱腫瘤內(nèi)T細胞的效應(yīng)功能，從而整體上減弱機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進自身生長。在發(fā)現(xiàn)LSECtin的這一功能之后，我們想知道腫瘤細胞表達的LSECtin是與T細胞表達的什么分子進行相互作用，來介導(dǎo)這一功能呢？通過對免疫抑制型受體相關(guān)文獻的挖掘并結(jié)合PRINCESS生物信息學工具的預(yù)測，我們獲得了幾個可能與LSECtin相互作用的分子，并通過表面離子共振法(SPR)篩選到其中LAG-3可以作為LSECtin相互作用

14、蛋白的候選分子。接下來，我們分別從物理上的相互作用，包括免疫共沉淀法（Co-immunopreiciation，Co-IP）、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)以及細胞粘附實驗確認了LAG-3能夠與LSECtin發(fā)生物理上的相互作用。從功能上，通過使用LAG-3的封閉性抗體，我們發(fā)現(xiàn)將LAG-3封閉之后，不論是外源的重組LSECtin，還是腫瘤細胞表達的內(nèi)源LSECtin，其對T細胞效應(yīng)功能的抑制均得到一定程度的回復(fù)。這些數(shù)據(jù)提示我們腫瘤細胞

15、表達的LSECtin很有可能是與T細胞表達的LAG-3發(fā)生相互作用，從而抑制T細胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而間接促進腫瘤自身的生長。
　　綜上所述，我們的研究結(jié)果顯示:LSECtin是表達在黑色素瘤細胞表面的共抑制分子，抑制T細胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進腫瘤的生長。LAG-3是表達在T細胞表面的共抑制分子，LSECtin可能與LAG-3相互作用抑制T細胞IFN-γ的分泌。LSECtin在黑色素瘤中的功能研究，揭示了機體對于黑色素瘤免疫耐