RecQ家族解旋酶在乳腺癌干細胞表達的初步研究.pdf

1、目的：探討篩選腫瘤干細胞的方法，在mRNA及蛋白質(zhì)水平檢測RecQ家族解旋酶在乳腺癌及其腫瘤干細胞中的表達水平，并探討其意義。
　　方法：（1）采用無血清懸浮培養(yǎng)方法，對乳腺癌細胞 MDA-MB-435進行無血清篩選培養(yǎng)。(2)Hoechst33342染料染色后流式細胞儀側(cè)群分析鑒定乳腺癌干細胞。（3）軟瓊脂糖凝膠腫瘤克隆形成試驗檢測乳腺癌干細胞成瘤性。（4）分別提取MDA-MB-435及其腫瘤干細胞、正常人肝細胞L-02、人臍帶

2、血干細胞、正常人淋巴細胞的Total RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，real—time PCR)檢測RecQ家族解旋酶(RecQL、BLM、WRN、RecQ4、RecQ5)的mRNA量，在轉(zhuǎn)錄水平探討乳腺癌細胞及其干細胞的RecQ家族解旋酶 mRNA差異。(5)WesternBlot檢測MDA-MB-435及其腫瘤干細胞、L-02、人肝癌細胞HepG2、正常人白細胞中

3、BLM及RecQ4的表達情況，在翻譯水平探討乳腺癌細胞及其腫瘤干細胞RecQ家族解旋酶差異。
　　結(jié)果：（1）采用無血清懸浮培養(yǎng)方法篩選和培養(yǎng)MDA-MB-435腫瘤干細胞成功。（2）Hoechst33342染料染色后流式細胞儀側(cè)群分析鑒定腫瘤干細胞占整個細胞比例90％以上。（3）軟瓊脂糖凝膠腫瘤克隆形成試驗檢測腫瘤干細胞成瘤性驗證腫瘤干細胞克隆性生長和成瘤潛能比 MDA-MB-435細胞明顯增強，有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。

4、（4)實時熒光定量 PCR(real-time quantitative PCR，real-time PCR)檢測RecQ家族解旋酶成員RecQL、BLM、WRN、RecQ4、RecQ5的mRNA在不同細胞中表達水平發(fā)現(xiàn):與 MDA-MB-435相比，RecQL,BLM,WRN在腫瘤干細胞表達較 MDA-MB-435明顯下降（P<0.05），相反，RecQ4，RecQ5在腫瘤干細胞表達較 MDA-MB-435明顯升高（P<0.05）。（

5、5） WesternBlot檢測MDA-MB-435細胞及其腫瘤干細胞、L-02、HepG2、正常人白細胞中 BLM解旋酶的表達，表達量從低到高依次為正常人白細胞、腫瘤干細胞、MDA-MB-435細胞、L-02、HY-2；RecQ4解旋酶的表達，表達量從低到高依次為正常人白細胞、MDA-MB-435細胞、腫瘤干細胞、L-02、HY-2。BLM在腫瘤干細胞表達較MDA-MB-435下降，RecQ4在腫瘤干細胞表達較MDA-MB-435升高