一種新的腫瘤相關抗原MGb2-Ag-TRAK1的鑒定和功能研究.pdf

1、【背景】
　　MGb2是本研究所建立的一種胃腸道腫瘤特異性單克隆抗體。利用該抗體檢測胃癌敏感性高、特異性強，對胃印戒細胞癌尤為明顯。但是，該抗體建立20年來，其識別抗原MGb2-Ag一直沒有鑒定成功，故對其的認識非常有限。
　　【目的】
　　進一步觀察MGb2-Ag在人體多種組織中的表達分布特征，明確其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的臨床病理診斷價值，鑒定MGb2-Ag，并研究其在腫瘤細胞中可能的作用。
　　【方法】
　

2、?。?）用免疫組化方法檢測人體多種組織中MGb2-Ag的表達分布特征。
　?。?）以141例胃癌（n=81）和非胃癌患者（n=60）的胃組織石蠟切片標本作為研究對象，用免疫組化方法評價MGb2-Ag在胃癌發(fā)生發(fā)展中的臨床病理診斷價值。免疫組化染色結果判斷結合染色細胞數(shù)量和染色程度進行綜合評分分析。
　　（3）用Westernblotting檢測7種胃癌細胞系和1種胃黏膜上皮細胞永生化細胞系GES-1中MGb2-Ag的表達，并

3、初步確定目的蛋白的分子量。
　　（4）以胃癌細胞系和新鮮胃癌組織為材料，用免疫沉淀技術（IP）富集MGb2-Ag，SDS-PAGE膠分離目的抗原后切膠進行MALDI-TOF質譜分析和生物信息學分析，獲得候選分子為TRAK1（Traffickingprotein,kinesin-binding1)。
　?。?）以下列方法進一步鑒定MALDI-TOF質譜分析結果：用抗TRAK1抗體和MGb2抗體檢測原核表達的TRAK1蛋白，用兩

4、種抗體分別檢測組織連續(xù)切片中TRAK1和MGb2-Ag蛋白的組織表達特征和亞細胞定位特征。
　?。?）借助RNAi（RNAinterference）技術，設計Trak1siRNAs，構建其表達質粒，轉染胃癌細胞系MKN-45，篩選有效靶序列，觀察轉染Trak1siRNAs對腫瘤細胞的細胞周期和細胞凋亡的影響。
　　【結果】
　?。?）MGb2-Ag在人體多種組織中的表達特征：組織和器官不同，MGb2-Ag表達水平不同；

5、在人癌組織，特別是胃癌中高表達；在處于癌前狀態(tài)的組織中（胃、結腸和膽囊等）弱表達；正常組織中幾乎不表達；在正常胰腺的胰島和腦灰質神經(jīng)元中，能夠觀察到特異性的表達。
　　（2）胃癌組織分化越差(P=0.015),腫瘤細胞侵襲深度越深(P<0.001)，腫瘤細胞淋巴結轉移的發(fā)生越多(P=0.011)，MGb2-Ag表達水平越高。隨機挑選胃癌患者癌旁組織標本（n=16）檢測MGb2-Ag，發(fā)現(xiàn)其在癌組織中的表達高于相應癌旁組織(P=0.

6、001)。同時，本研究觀察到慢性淺表性胃炎組織中MGb2-Ag的表達低于其在癌前狀態(tài)組織（本研究包括萎縮性胃炎、腸上皮化生、胃息肉）中的表達（P=0.005）。MGb2-Ag在胃癌中陽性率為81.48％（66/81），其中，在胃印戒細胞癌和粘液細胞癌的中陽性率為100％(23/23)；MGb2-Ag在癌前狀態(tài)組織中陽性率為13.16％(5/38)，在慢性淺表性胃炎組織中陽性率為0％（0/22）；胃癌組織中MGb2-Ag的陽性率高于所有非

7、癌組織（P<0.001）。
　?。?）MGb2-Ag在7種胃癌細胞系中呈不同程度的表達，但在人永生化胃黏膜細胞系GES-1中的表達很弱。該抗原用Westernblotting可檢測到2條蛋白質條帶，分子量分別為～115kDa和～100kDa，所有細胞樣品皆有的條帶是～100kDa。明顯呈兩條條帶的細胞是MKN-45、SGC-7901和AGS細胞。
　?。?）切取從MKN-45細胞、KATOIII細胞和胃癌組織中富集到的目的抗

8、原MGb2-Ag條帶（～100kDa），MALDI-TOF質譜分析結果均顯示候選分子均為TRAK1。原核表達的TRAK1蛋白能夠被MGb2單抗和羊TRAK1多抗所識別。用MGb2單抗和羊TRAK1多抗檢測胃癌、腸上皮化生、慢性淺表性胃炎等組織的連續(xù)切片，發(fā)現(xiàn)染色定位、細胞類型等特征高度一致。
　?。?）成功構建Trak1siRNA表達載體，篩選出2對針對Trak1的siRNA，瞬時轉染MKN-45細胞，與對照siRNA比較，兩者均

9、顯著減少細胞凋亡，促進細胞周期從G1期向S期進展。
　　【結論】
　　本研究進一步觀察了MGb2-Ag在人體多種組織的分布特征；發(fā)現(xiàn)MGb2-Ag是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中一種有意義的病理診斷標志物，MGb2-Ag表達增加可能是胃癌發(fā)生的早期事件；成功鑒定MGb2-Ag為一種新分子TRAK1，首次發(fā)現(xiàn)TRAK1是一種新的胃癌診斷標志物；本研究還借助RNAi介導的TRAK1低表達效應，首次研究了TRAK1在腫瘤細胞中的功能，發(fā)現(xiàn)轉染