基于ND4和微衛(wèi)星標(biāo)記的中國柑橘大實蠅種群遺傳結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、柑橘大實蠅Bactrocera(Tetracus) minax(Enderlein)，又名中國果實蠅、柑蛆，是一種隸屬于雙翅目Diptera、實蠅科Tephdtida、果實蠅屬Bactrocera Macquart的檢疫性害蟲，目前已在中國、印度、不丹和尼泊爾等亞洲國家報道發(fā)生。據(jù)現(xiàn)有統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，柑橘大實蠅在中國已在7省市主要發(fā)生為害，對柑橘生產(chǎn)造成了巨大的損失，故了解柑橘大實蠅的遺傳結(jié)構(gòu)，分析推測其擴散路徑，對制定柑橘大實蠅的防控措

2、施具有重大的意義。本研究通過擴增柑橘大實蠅1個線粒體DNA(mtDNA)基因片斷和4個微衛(wèi)星位點(microsatellite loci)，采用遺傳多樣性參數(shù)分析、系統(tǒng)發(fā)育樹分析和譜系生物地理學(xué)分析等方法，首次對采自中國大陸18個不同地區(qū)的柑橘大實蠅種群進(jìn)行系統(tǒng)而深入的比較研究，獲得以下主要結(jié)論:
　　1.分子標(biāo)記的確定
　　對于線粒體基因分子標(biāo)記的選定，根據(jù)前人研究，我們以柑橘大實蠅線粒體的COX1、CYTB、ND4和ND

3、5基因作為初選目標(biāo)。然后，按照A+T含量(％)、多態(tài)性位點數(shù)、簡約信息位點數(shù)、自裔位點數(shù)、單倍型數(shù)和核酸多樣性等6種基因多樣性指數(shù)，并結(jié)合去掉前后引物后基因片段長度必須要大于500bp的原則對其進(jìn)行篩選分析，其中，四個線粒體基因片段的6種基因多樣性指數(shù)分別為:COX1,56.40、56、30、26、7、0.0092; CYTB,61.74、40、23、17、5、0.0147;ND4,65.50、64、42、22、11、0.0116; N

4、D5,66.20、36、22、14、9、0.0102。結(jié)果表明，ND4基因是這四個基因中在柑橘大實蠅上進(jìn)化率最高的線粒體基因，故選擇ND4基因片段來作為柑橘大實蠅線粒體分子標(biāo)記。
　　2.微衛(wèi)星標(biāo)記的確定
　　為了高效篩選合適的微衛(wèi)星引物進(jìn)行柑橘大實蠅遺傳結(jié)構(gòu)研究，我們首先從柑橘大實蠅同屬種柑橘小實蠅Bactrocera dorsalis、木瓜實蠅Bactrocera papayae、瓜實蠅Bactrocera cucurb

5、ita、東澳番茄實蠅Bactrocera cacuminata中挑選多態(tài)性較好的33對微衛(wèi)星引物，再對其各PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳的初篩選，及6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的再篩選，之后對其等位基因頻率、多態(tài)信息含量和有效等位基因數(shù)等指數(shù)進(jìn)行了分析。最終篩選出6對在柑橘大實蠅多態(tài)性表現(xiàn)較好的微衛(wèi)星引物，分別為位點Bp125(PIC=0.1546)、BcuB5.2(PIC=0.4105)、BcuF1.6(PIC=0.3086)、Bd47(

6、PIC=0.0886)、Bcac5.10(PIC=0.2745)和Bcac6.12(PIC=0.1118)。最后，根據(jù)多重PCR條件的限制（兩對目的基因片段長度差異要在30bp以上，且兩對引物不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體），選擇了其中的4對引物（Bp125、BcuF1.6、Bcac5.10和Bcac6.12）來作為柑橘大實蠅的微衛(wèi)星標(biāo)記。
　　3.柑橘大實蠅遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性
　　本實驗共擴增了18個柑橘大實蠅種群的359個個

7、體的ND4基因片段序列和478個個體的4個微衛(wèi)星位點信息，其中在ND4基因中，共發(fā)現(xiàn)了93個變異位點，獲得了91個單倍型;在4個微衛(wèi)星位點上，則分別檢測到7、14、9和8個等位基因，在各個種群上則各檢測到19到30個等位基因不等，平均為23.06個等位基因。結(jié)果表明，18個柑橘大實蠅種群具有豐富的多態(tài)位點數(shù)和單倍型，且高度的等位基因雜合性也表明柑橘大實蠅的遺傳多樣性較高。
　　柑橘大實蠅的ND4序列集和微衛(wèi)星數(shù)據(jù)集SAMOVA分析

8、結(jié)果（柑橘大實蠅種群間的遺傳變異在18個種群中所占比例較高，為38.01％）表明，柑橘大實蠅的遺傳結(jié)構(gòu)較弱。同時，18個柑橘大實蠅種群AMOVA對遺傳固定系數(shù)Fsr分析結(jié)果表明，柑橘大實蠅種群間存在明顯的遺傳分化，但微衛(wèi)星數(shù)據(jù)集的遺傳固定系數(shù)值要比ND4序列集的偏低，其原因可能是柑橘大實蠅的純合體偏多和在微衛(wèi)星位點上出現(xiàn)了一些無效等位基因。
　　4.柑橘大實蠅在中國大陸的擴散中心及路徑分析
　　結(jié)合18個柑橘大實蠅種群的ND

9、4序列集和微衛(wèi)星數(shù)據(jù)集的遺傳分化系數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育樹、基因流分析結(jié)果，我們對柑橘大實蠅在中國大陸的擴散中心和主要擴散路徑作出以下推斷:
　　(1)通過對比鄰近柑橘大實蠅種群間的遺傳分化系數(shù)和基因流值，尤其是重慶5個種群間，因此，我們認(rèn)為柑橘大實蠅可能具有某種“戀家”行為—即其不會主動由其定居的山區(qū)向四周擴散。
　　(2)對柑橘大實蠅3大組群和總體的遺傳分化系數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)和基因流值（遷入率和遷出率的不對稱性）分析發(fā)現(xiàn)，華南組

10、群處于整個系統(tǒng)發(fā)育樹的中部，組群的遷出率遠(yuǎn)大于其遷入率（分別為22.785和1.175），且與其他組群間的遺傳分化系數(shù)較小，因此，我們認(rèn)為華南組群應(yīng)為柑橘大實蠅在中國大陸的擴散中心。
　　(3)同時，我們發(fā)現(xiàn)華中組群的十堰種群在18個柑橘大實蠅種群中處于特殊位置，十堰與其他種群的遺傳分化值相較其他種群間較小，且十堰種群的基因流也為主遷出，故我們認(rèn)為十堰應(yīng)為柑橘大實蠅在中國大陸的“橋頭堡”。
　　綜上所述，我們推測柑橘大實蠅在

11、華南開始向外擴散，后經(jīng)華中的十堰為“中轉(zhuǎn)站”，向華中其他地區(qū)和西部地區(qū)擴散，特別是向西南地區(qū)擴散。
　　5.重慶柑橘大實蠅的來源地分析
　　對于柑橘大實蠅主發(fā)生地之一，我們對柑橘大實蠅在重慶的擴散模式和種群間的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析。重慶5個種群（武隆、忠縣、萬州、云陽和巫山種群）間，幾乎沒有共享單倍型，且Structure分析結(jié)果顯示，忠縣種群應(yīng)為華南種群近幾年傳入，而武隆、萬州和巫山這3個種群則與華中的荊州種群遺傳結(jié)構(gòu)近似，