高密度Oligo基因芯片篩選小鼠前腦發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的研究.pdf

1、嗅球(OB)的中間神經(jīng)元具有終生更新的能力，它們?cè)谂咛テ谥饕赏鈧?cè)神經(jīng)節(jié)突起區(qū)(LGE)的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)遷移、分化而來(lái)；出生后，則主要由位于室管膜前下區(qū)(SVZa)的NSCs遷移、分化而來(lái)?；蛐酒夹g(shù)提供了一個(gè)可以同時(shí)研究多個(gè)基因動(dòng)態(tài)改變的技術(shù)平臺(tái)。本課題采用16，844點(diǎn)的高密度Oligo基因芯片對(duì)發(fā)育期小鼠前腦四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(Embryonicday16(E16)，Postnatalday1(P1)、P7和P21)、三個(gè)部位(

2、OB、RMS及SVZa)的基因表達(dá)情況加以研究，探討在鏈?zhǔn)竭w移過(guò)程中NSCs增殖、遷移及分化的分子機(jī)制，有以下發(fā)現(xiàn)： 一、基因芯片實(shí)驗(yàn)部分基因芯片采用北京博奧生物公司16，844點(diǎn)的小鼠Oligo芯片，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Ⅱ型設(shè)計(jì)，并進(jìn)行熒光交換實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組樣品為同一時(shí)間點(diǎn)、同一部位組織混合后得到的12個(gè)樣品，共同對(duì)照樣品由四個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠全腦總RNA等量混合而成。芯片雜交后，將掃描圖像信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，然后對(duì)數(shù)據(jù)用非線性方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化

3、處理，芯片上的每一個(gè)基因都會(huì)得到熒光交換前后的2個(gè)表達(dá)比值(Ratio)，只有在兩次雜交實(shí)驗(yàn)中變化趨勢(shì)相同的基因才被認(rèn)為是真正有差異表達(dá)的基因。進(jìn)而將同一基因熒光交換前后的2個(gè)Ratio值取其幾何平均數(shù)作為該基因表達(dá)的Ratio值，共得到12組表達(dá)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)是后續(xù)研究小鼠前腦基因表達(dá)時(shí)空分布特點(diǎn)的基礎(chǔ)。 二、基因芯片數(shù)據(jù)驗(yàn)證部分從基因芯片結(jié)果中挑選12個(gè)組織都表達(dá)的基因--同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(Distal-lesshomeob

4、ox2，DLX2)，采用SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)相對(duì)定量熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)DLX2基因在發(fā)育小鼠前腦中的表達(dá)情況，并將所得結(jié)果與基因芯片數(shù)據(jù)相比較，以此驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)的可靠性。通過(guò)比較，兩組數(shù)據(jù)的表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，也間接證實(shí)芯片數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性，后者也是進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析得出可靠結(jié)果的基礎(chǔ)。 三、基因芯片數(shù)據(jù)初步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析主要采用系統(tǒng)聚類、基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及統(tǒng)計(jì)分析中常用的方法等對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了初步分析。 1、首先將

5、基因分成“活動(dòng)”基因和“差異”基因?！盎顒?dòng)”基因：在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)中都有表達(dá)的基因，有表達(dá)的點(diǎn)包括表達(dá)沒(méi)有顯著改變、上調(diào)、下調(diào)、開(kāi)和關(guān)基因?！安町悺被颍菏紫缺仨殲椤盎顒?dòng)”基因，還要求四個(gè)時(shí)間點(diǎn)中最大Ratio值/最小Ratio值的比值大于2。 2、以“活動(dòng)”基因的標(biāo)準(zhǔn)在原始數(shù)據(jù)中進(jìn)行篩選，并對(duì)這些“活動(dòng)”基因按組織的分布進(jìn)行分類，得到三組基因只在一種組織內(nèi)表達(dá)的基因(OB：64；RMS：223；SVZa：687)，三組基因只在兩種

6、組織內(nèi)表達(dá)的基因(OB_RMS：64；OB_SVZa：423；SVZa_RMS：372)，三個(gè)組織都表達(dá)的“活動(dòng)”基因有1847個(gè)。1847個(gè)“活動(dòng)”基因按功能進(jìn)行分類，除了Unclassified基因外，Metabolism，Transport及Signal功能組包含的數(shù)目最多。1847個(gè)基因組織聚類分為6大功能類，C(1)-541、C(2)-194、C(3)-421、C(4)-114、C(5)-343、C(6)-324。功能分布分析

7、顯示Transport功能組在各聚類族中分布是不同的。1847個(gè)基因空間聚類顯示，在兩個(gè)或三個(gè)組織中有6組基因的表達(dá)趨勢(shì)相似，提示這些基因在NSCs的增殖、遷移及分化中，在不同的部位有著相似的表達(dá)模式。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)RMS含有與其它兩個(gè)部位表達(dá)趨勢(shì)相似最多的基因，而OB與SVZa之間最少。對(duì)1847個(gè)基因分組織功能分布分析顯示，各功能組分別在三個(gè)組織的聚類族中分布相同，說(shuō)明各功能組分別在三個(gè)組織發(fā)育中的分布是隨機(jī)的。對(duì)它們分組織進(jìn)行候選基因

8、篩選顯示，三個(gè)部位中候選基因的個(gè)數(shù)分別為：Celldifferentiation(OB：2，RMS：2，SVZa：2)，Responsetostress(OB：2，RMS：2，SVZa：2)，Development(OB：16，RMS：14，SVZa：15)，其中Development功能組的候選基因數(shù)目最多。時(shí)點(diǎn)變換分析中以相關(guān)系數(shù)(Correlationcoefficient，CC)大于+0.99和小于-0.99作為有意義的正相關(guān)和

9、負(fù)相關(guān)的分類標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)基因進(jìn)行相關(guān)分類，從這些基因中挑選出了有意義的基因。 3、以“差異”基因的分類標(biāo)準(zhǔn)在原始數(shù)據(jù)中進(jìn)行篩選，得到三組基因只在一種組織內(nèi)表達(dá)的基因(OB：149；RMS：616；SVZa：342)，三組基因只在兩種組織內(nèi)表達(dá)的基因(OB_RMS：118；OB_SVZa：89；SVZa_RMS：252)，三個(gè)組織都表達(dá)的“差異”基因有267個(gè)。267個(gè)三個(gè)組織都表達(dá)的“差異”基因按功能進(jìn)行分類中，除了Unclass

10、ified基因外，Metabolism，Transport及Development發(fā)育功能組包含的數(shù)目最多。267個(gè)基因組織聚類分為8大功能類：C(1)-15、C(2)-64、C(3)-26、C(4)-45、C(5)-33、C(6)-21、C(7)-38、C(8)-25。結(jié)果提示在P21時(shí)間點(diǎn)三個(gè)部位的“差異”基因表達(dá)趨勢(shì)高度相似，OB部位的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(E16，P1，P21)“差異”基因的表達(dá)趨勢(shì)穩(wěn)定。功能分布分析顯示每個(gè)功能組的分布都

11、為非隨機(jī)的?？臻g聚類發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)或三個(gè)組織中有7組“差異”基因的表達(dá)趨勢(shì)相似，RMS含有與其它兩個(gè)部位表達(dá)趨勢(shì)相似最多的差異基因，而OB與SVZa之間最少。候選基因篩選分析顯示，Development功能組在三個(gè)部位中候選基因的數(shù)目最多，OB及RMS兩個(gè)部位只篩選到Development功能組候選基因。相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析中，在相關(guān)系數(shù)取大于+0.99或小于-0.99水平，得到26個(gè)基因，11個(gè)網(wǎng)絡(luò)。 4、三個(gè)組織各自的差異表達(dá)基因的系統(tǒng)

12、聚類分析中，分別得到如下差異表達(dá)基因：OB-623，RMS-1253，SVZa-950。對(duì)這些基因分別進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析顯示，OB組聚類后基因分為4類(C1-215，C2-158，C3-124，C4-126)，RMS組聚類后基因分為5類(C1-334，C2-93，C3-312，C4-301，C5-215)，SVZa組聚類后基因分為5類(C1-132，C2-268，C3-114，C4-292，C5-144)。三個(gè)組織各自的區(qū)域特異性差異表達(dá)

13、基因?yàn)椋篛B-149，RMS-616，SVZa-342。對(duì)這些基因分別進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析顯示，OB組聚類后基因分為4類(C1-44，C2-20，C3-39，C4-46)，RMS組聚類后基因分為7類(C1-30，C2-165，C3-48，C4-39，C5-103，C6-129，C7-102)，SVZa組聚類后基因分為6類(C1-50，C2-119，C3-16，C4-50，C5-99，C6-8)。 四、基因芯片生物學(xué)分析1、OB差異表

14、達(dá)基因中與酪氨酸羥化酶(Tyrosinehydroxylase，TH)相關(guān)基因的研究。通過(guò)對(duì)623個(gè)OB不同發(fā)育階段的共表達(dá)差異基因的聚類分析，進(jìn)而對(duì)這些基因進(jìn)行了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，在相關(guān)系數(shù)設(shè)定為+0.95和-0.95水平上，共篩選出18個(gè)與TH相關(guān)的基因。18個(gè)基因中已知功能的基因有8個(gè)，未知功能的基因有10個(gè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這18個(gè)基因與TH基因間有較高的相關(guān)性，它們參與了TH基因的表達(dá)調(diào)控。通過(guò)18個(gè)基因在OB差異基因聚類分析中

15、位置的研究，得到C1組7個(gè)、C2組3個(gè)、C3組2個(gè)、C4組6個(gè)。 2、OB、RMS及SVZa差異表達(dá)基因中與DLX2相關(guān)基因的研究。通過(guò)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析三個(gè)組織中DLX2相關(guān)基因的研究顯示：OB中相關(guān)系數(shù)設(shè)定為+0.95和-0.95的水平時(shí)，共篩選出29個(gè)與DLX2相關(guān)的基因。29個(gè)基因在OB差異基因聚類分析基因分類中的位置研究，得到C1組5個(gè)，C2組4個(gè)，C3組8個(gè)，C4組12個(gè)；RMS中在相關(guān)系數(shù)設(shè)定為+0.99和-0.99

16、的水平時(shí)，共篩選出43個(gè)與DLX2相關(guān)的基因。43個(gè)基因在RMS差異基因聚類分析基因分類中的位置研究，得到C1組29個(gè)，C2組0個(gè)，C3組13個(gè)，C4組0個(gè)，C5組1個(gè)。SVZa中在相關(guān)系數(shù)設(shè)定為+0.995和-0.995的水平時(shí)，共篩選出34個(gè)與DLX2相關(guān)的基因。34個(gè)基因在SVZa差異基因聚類分析基因分類中的位置研究，得到C1組0個(gè)，C2組23個(gè)，C3組0個(gè)，C4組11個(gè)，C5組0個(gè)。本研究的結(jié)果顯示，這些基因分別在不同的部位與D