短發(fā)夾狀RNA干擾對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中HMGB1基因表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：研究短發(fā)夾狀RNA（shRNA）干擾對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞（RL95-2）中HMGB1基因表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響。 方法：觀察由HMGB1基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo介導(dǎo)的HMGB1shRNA對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞（RL95-2）增殖的影響，將HMGB1基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒pGPU6-shRNA轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系RL95-2細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)分組如下：①實(shí)驗(yàn)組（RL95-2 HMGB1/p-shRNA）②

2、空載體對(duì)照組（RL95-2/p）③轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組（RL95-2/mock-control）④陽性對(duì)照組（RL95-2GAPDH/p-shRNA）⑤陰性對(duì)照組（RL95-2 HMGB1/p-NC）⑥空白組（RL95-2）。用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后各組細(xì)胞的HMGB1mRNA的表達(dá)效應(yīng)，Western-blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后各組細(xì)胞的HMGB1蛋白水平的表達(dá)，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后各組細(xì)胞

3、的增殖狀況，每組重復(fù)試驗(yàn)5次，取3次結(jié)果計(jì)算，以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。 結(jié)果：（1）重組質(zhì)粒pGPU6-HMGB1 shRNA核酸序列分析結(jié)果顯示，靶向HMGB1基因的shRNA模板片段已經(jīng)插入到RNAi專用的pGPU6/GFP/Neo Express質(zhì)粒中，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致。（2）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可見綠色熒光蛋白表達(dá)示轉(zhuǎn)染成功，且觀察到轉(zhuǎn)染率最高可達(dá)到（73.267±1.626）％。（3）RT-PCR：將HMGB1 pGPU6

4、-shRNA轉(zhuǎn)染RL95-2細(xì)胞后2d，實(shí)驗(yàn)組的HMGB1mRNA表達(dá)量是空白組的0.05倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2-ΔΔCt<0.5），實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，空載體對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組、陰性對(duì)照組和空白組兩兩相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（4）Western-blot法：將HMGB1pGPU6-shRNA轉(zhuǎn)染RL95-2細(xì)胞后2d，實(shí)驗(yàn)組的HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.153±0.004，與空白組的0.568±0.005

5、相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；與陽性對(duì)照組的0.158±0.006相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；空載體對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組、陰性對(duì)照組和空白組兩兩相比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（5）MTT比色法檢測(cè)顯示：在轉(zhuǎn)染后的1d、2d、3d、4d、5d，實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組和空載體對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組、陰性對(duì)照組、空白組相比較，增殖明顯減慢，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），而實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，空載體對(duì)照組、轉(zhuǎn)