急性HBV感染模型中NK細胞的免疫調節(jié)機制研究.pdf

1、HBV屬于嗜肝DNA病毒科，是有包膜病毒并含有大約3.2kb的環(huán)狀雙鏈DNA基因組。HBV感染可導致有或無臨床表征的肝炎。雖然已經研發(fā)出預防性的高效疫苗，但是全球仍有大約3.5億人是慢性HBV感染者并且有發(fā)展為晚期肝臟疾病以及肝癌的風險。HBV的有效清除依賴于患者的年齡和免疫狀態(tài)，免疫應答低下導致持續(xù)性或者慢性HBV感染。因此，宿主的免疫應答在HBV感染過程中具有重要的作用。
　　 一直以來，免疫學家們認為適應性免疫系統(tǒng)在HBV

2、的清除和致病方面具有重要的作用，相比之下，作為天然免疫系統(tǒng)重要成分的NK細胞在HBV感染中的作用卻不是很清楚。雖有文獻表明清除小鼠的NK細胞導致HBV耐受的現(xiàn)象，以及急性HBV患者清除HBV的感染伴隨著體內NK細胞活化的現(xiàn)象，但是對于HBV感染后NK細胞如何發(fā)揮抗HBV感染功能則知之甚少。近來，有很多關于NK細胞對適應性免疫系統(tǒng)調節(jié)的報道。但是HBV感染過程中NK細胞是否具有對適應性免疫系統(tǒng)的調節(jié)功能也不是很清楚。因而，NK細胞在HBV

3、感染過程中是否具有重要的作用，以及NK細胞是否參與對后續(xù)適應性免疫應答的調節(jié)，以及兩大免疫系統(tǒng)如何相互協(xié)調介導HBV的清除？這正是我們所關心的問題。
　　 因此，本論文的研究目的在于研究HBV清除的免疫學機制，探討HBV感染過程中是否需要NK細胞的參與，以及重點探索NK細胞是否介導對適應性免疫細胞的活化，以期為臨床慢性HBV患者的治療以及疫苗的研制提供新的策略。
　　 在本論文中對小鼠尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2

4、質粒，建立了小鼠急性HBV感染模型。利用該模型我們深入探討了HBV清除的免疫學機制以及NK細胞如何誘導適應性免疫系統(tǒng)啟動而清HBV感染。根據CD8-/-小鼠血清HBV相關抗原的檢測以及體外阻斷CD8+T細胞后上清中細胞因子的分泌情況評估CD8+T細胞在HBV清除中的作用;采用流式細胞術檢測NK細胞的活化，以及利用NK細胞清除和轉輸實驗證明NK細胞如何參與抗HBV感染;通過對缺陷小鼠的特定細胞清除及過繼轉輸實驗檢測NK細胞對CD8+T細胞

5、的影響;清除CD4-/-小鼠的NK細胞研究其是否參與NK細胞所介導的抗病毒及促進CD8+T細胞的活化;利用轉輸實驗及流式細胞術檢測NK細胞對CD4+T細胞的調節(jié);通過抗體阻斷實驗進一步證明DCs亦受到NK細胞的調節(jié)。另外，通過肝內注射及尾靜脈高壓注射Ad-EGFP實驗，以及手術摘除實驗、體內外分析肝臟淋巴結細胞等實驗驗證肝臟淋巴結與肝臟的關系。利用免疫放射法(IRMA)定量檢測小鼠血清中HBsAg，HBeAg，anti-HBs，HBVD

6、NA以及ALT水平，以及H-E染色和免疫組化分析來WT小鼠以及缺陷小鼠中病毒的清除特點;CBA檢測培養(yǎng)上清中細胞因子的變化;流式細胞術檢測NK細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞以及DCs的表型變化以及胞內細胞因子的表達情況。通過上述一系列的研究方法，我們取得如下的實驗結果:
　　 1.CD8+T細胞參與無細胞病變性在HBV清除過程中具有重要的作用
　　 通過對C57BL/6小鼠高壓尾靜脈注射20μgpAAV/HBV質粒

7、，檢測血清HBsAg，HBeAg，anti-HBs，HBVDNA以及ALT水平。結果表明HBV在感染小鼠體內能夠實現(xiàn)HBV的復制，且表達HBV相關抗原，WT小鼠可在HBV感染后3-4周內清除病毒感染，但是不引起肝細胞損傷和淋巴細胞浸潤，即為無細胞病變性感染模型，類似于人類急性HBV感染。為了進一步檢測HBV的清除是否有免疫系統(tǒng)的參與，我們檢測CD8-/-小鼠在該模型中的特點，提示CD8-/-小鼠血清HBsAg和HBeAg均明顯高于WT小

8、鼠。分離WT小鼠脾臟的淋巴細胞，體外用α-CD8抗體阻斷CD8+T細胞的作用，導致脾臟淋巴細胞IFN-γ及TNF-α分泌能力均明顯降低，上述結果表明提示CD8+T細胞對于急性HBV感染模型中HBV的清除具有重要的作用。
　　 2.NK細胞來源的IFN-γ促進HBV的清除
　　 我們在該模型中發(fā)現(xiàn)HBV質粒高壓注射后第3天，脾臟NK細胞明顯增加，且CD69表達亦明顯增加。NK細胞在HBV質粒高壓注射后第5天和第7天IFN-

9、γ表達明顯增加。為進一步研究NK細胞在HBV清除中的作用，我們清除WT小鼠體內的NK細胞，肝組織病理染色結果表明NK細胞清除小鼠的肝組織HBcAg表達以及血清HBsAg及HBeAg表達明顯高于對照小鼠。同樣NK細胞缺陷小鼠Nfi13-/-小鼠在HBV質粒高壓注射后亦不能清除HBV感染，而且分別轉輸WT小鼠的NK細胞和GKO小鼠的NK細胞至Nfi13-/-小鼠，則發(fā)現(xiàn)轉輸WT小鼠的NK細胞其血清HBsAg低于轉輸GKO小鼠NK細胞組。另外

10、對NK細胞清除小鼠尾靜脈注射mIFN-γ可以明顯降低NK細胞清除所導致血清HBsAg的升高。因此，上述結果表明NK細胞來源的IFN-γ是參與HBV清除的主要功能。
　　 3.NK細胞來源的IFN-γ促進抗HBVCD8+T細胞免疫應答
　　 上述結果提示HBV清除過程中既需要CD8+T細胞的參與，又依賴于NK細胞的作用。那么二者之間是否存在調節(jié)作用呢？我們清除WT小鼠體內NK細胞，發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞數(shù)目明顯減低;肝臟和脾臟

11、CD8+T細胞CD44+CD62L（-）CD8+T表達以及分泌IFN-γ明顯減低;(-)且NK細胞清除小鼠的肝臟HBV-特異性CD8+T細胞的活化明顯減低。為了明確NK細胞分泌的IFN-γ促進CD8+T細胞的免疫應答，我們清除CD8-/-小鼠體內NK細胞，轉輸CFSE標記的CD8+T細胞，并同時向NK細胞清除CD8-/-小鼠體內分別轉輸WT小鼠的NK細胞以及GKO(Ifn-/-)小鼠的NK細胞，我們發(fā)現(xiàn)CFSE-CD8+T細胞在清除NK

12、細胞的受體中的增殖以及分泌IFN-γ的能力與對照小鼠(不清除NK細胞組)相比均明顯下降。轉輸WT小鼠的NK細胞則能促進CFSE-CD8+T細胞的增殖以及分泌IFN-γ。相比之下，轉輸GKO小鼠NK細胞其促進CFSE-CD8+T細胞的增殖及分泌IFN-γ的能力相對較弱。另外，轉輸CFSE-CD8+T胞至GKO小鼠體內，并對一些受體小鼠轉輸WT小鼠的NK細胞，結果表明轉輸WT小鼠的NK細胞的受體小鼠，其肝臟和脾臟中CFSE-CD8+T細胞的

13、增殖及分泌IFN-γ明顯增強。綜上所述，NK細胞分泌的IFN-γ促進CD8+T細胞的免疫應答。
　　 4.NK細胞促進抗HBV-CD8+T細胞的再次免疫應答
　　 接下來，分選HBV質粒高壓注射后第5天的脾臟CD8+T細胞并標記CFSE，分別轉輸至NK細胞清除小鼠及對照小鼠體內，24小時后對受體小鼠高壓注射HBV質粒。發(fā)現(xiàn)NK細胞參于脾臟抗HBVCD8+T細胞的再次免疫應答。為了進一步佐證此觀點，我們又分選了HBV質粒高

14、壓注射后第14天的肝臟CD8+T細胞并標記CFSE，分別轉輸至NK細胞清除小鼠及對照小鼠體內。同樣發(fā)現(xiàn)NK細胞清除小鼠的肝臟和脾臟中CFSE-CD8+T細胞的增殖及分泌IFN-γ的能力明顯下降。因此，NK細胞參于來自于肝臟或脾臟的抗HBVCD8+T細胞的再次免疫應答。
　　 5.CD4+T細胞在NK細胞抗HBV感染及抗HBVCD8+T細胞活化中的作用
　　 為了檢測CD4+T細胞是否在NK細胞控制HBV的感染及調節(jié)CD8

15、+T細胞的活化中發(fā)揮作用，我們檢測Rag1-/-和CD4-/-小鼠清除HBV的情況，結果表明Rag1-/-和CD4-/-小鼠體內雖然存在NK細胞，但是其不能發(fā)揮抗HBV作用。進一步清除Rag1-/-和CD4-/-小鼠中NK細胞，發(fā)現(xiàn)血清HBsAg的亦無明顯變化。而WT小鼠中NK細胞可控制HBV的感染。進一步實驗發(fā)現(xiàn)CD4-/-小鼠體內NK細胞不能促進CD8+T細胞分泌IFN-γ，因為WT小鼠的NK細胞明顯促進HBV特異性CD8+T細胞分

16、泌IFN-γ。清除CD4-/-小鼠體內的NK細胞也不能明顯改變CD4-/-小鼠體內CD8+T細胞分泌IFN-γ。因此我們認為CD4-/-小鼠的NK細胞間接抗HBV作用，以及間接調節(jié)CD8+T細胞。且NK細胞的抗病毒作用依賴于CD4+T細胞的存在。上述結果表明，CD4+T細胞不僅介導NK細胞的抗HBV感染，也參與其對CD8+T細胞的調節(jié)。
　　 6.CD4+T細胞輔助產生抗HBVCD8+T細胞免疫應答
　　 上述結果表明C

17、D4+T細胞參與HBV的清除，我們進一步檢測CD4-/-小鼠清除HBV的能力，結果表明CD4-/-小鼠血清HBsAg和HBeAg均明顯高于WT小鼠，而且HBV質粒高壓注射后第8周也不能清除HBV感染。提示CD4+T細胞也參與HBV的清除過程。轉輸小鼠的CD8+T細胞至Rag1-/-小鼠并不能幫助該小鼠清除HBV感染，提示CD8+T細胞抗HBV感染需要CD4+T細胞的輔助。另外，體外阻斷小鼠脾臟CD4+T細胞的作用，亦導致脾臟淋巴細胞分泌

18、IFN-γ下調。因此，CD8+T細胞發(fā)揮抗HBV感染功能需要CD4+T細胞輔助。
　　 7.NK細胞促進CD4+T細胞免疫應答
　　 既然CD4+T細胞輔助CD8+T細胞抗病毒免疫應答，而且NK細胞也促進CD8+T細胞的免疫應答。CD4+T細胞與NK細胞之間可能存在調節(jié)關系。比較CD4-/-小鼠與WT小鼠中NK細胞的功能，結果表明CD4-/-小鼠中NK細胞的功能正常。進一步檢測NK細胞是否調節(jié)CD4+T細胞的功能，轉輸C

19、FSE標記的CD4+T細胞至CD4-/-小鼠體內，發(fā)現(xiàn)NK細胞清除導致CFSE-CD4+T細胞在受體小鼠的肝臟和脾臟的增殖及IFN-γ分泌明顯減低。且分離來自于NK細胞清除小鼠的肝臟CD4+T細胞，體外經Core129肽段刺激，產生分泌IFN-γ的HBV-特異性-CD4+T細胞的能力亦明顯減低。以上結果表明NK細胞不受到CD4+T細胞的調節(jié)，且NK細胞促進CD4+T細胞的抗HBV免疫應答。
　　 8.NK細胞分泌的IFN-γ促進

20、CD11b+DCs免疫應答
　　 NK細胞清除小鼠脾臟CD11b+DCs明顯減低，且CD11b+DCs表面CD86和CD80的表達也明顯下降，且脾細胞IL-18，IL-15和IFN-α的mRNA表達水平明顯下調。尾靜脈注射IFN-γ以清除小鼠體內的IFN-γ，發(fā)現(xiàn)該小鼠脾臟CD11b+DCs的表達亦明顯下降下降，且脾細胞IL-15和IFN-α的mRNA表達水平亦下調。因此，NK細胞分泌的IFN-γ亦促進脾臟CD11b+DCs的活

21、化，其可能介導后續(xù)適應性免疫應答的活化。
　　 9.肝臟淋巴結對于HBV免疫應答發(fā)生的影響
　　 另外，通過對小鼠肝內注射以及高壓尾靜脈注射Ad-EGFP，發(fā)現(xiàn)肝臟門部右側的淋巴結可以引流肝臟EFGP+細胞，提示肝臟淋巴結引流肝臟的細胞。并且發(fā)現(xiàn)肝臟淋巴結能產生抗HBV特異性免疫應答。進一步實驗表明手術摘除肝臟淋巴結導致大約30％的HBV耐受小鼠出現(xiàn)，而摘除脾臟卻不影響小鼠HBV感染情況。進一步確證了HBV感染模型中肝臟

22、淋巴結發(fā)生抗HBV的免疫應答。檢測HBV感染后肝臟淋巴結細胞表型，發(fā)現(xiàn)HBV感染后CD8+T細胞及DCs發(fā)生增殖。因此，肝臟淋巴結可以發(fā)生針對HBV特異性免疫應答。
　　 綜上所述，我們對成年雄性小鼠高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2質粒，建立模擬人類急性HBV感染的小鼠HBV感染模型。通過研究我們詳細闡述了HBV清除的免疫學機制，明確了NK細胞在HBV的清除中的重要作用，證明了NK細胞分泌的IFN-γ介導了后續(xù)適應性免疫的活