IFN-α調(diào)節(jié)NK細胞CD100表達在抗HCV感染中的分子機制研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是全球性嚴重的健康問題,目前約有1.3～1.7億人群感染HCV,其中70％~80%的患者發(fā)展為慢性。病毒持續(xù)感染,部分患者可發(fā)展為終末期肝病,如肝硬化和/或肝細胞癌。經(jīng)過聚乙二醇化干擾素(Pegylated interferon,Peg-IFN)-α聯(lián)合利巴韋林的標準化抗病毒治療,可使約55%人群獲得持續(xù)性病毒學應答(sustained virological respons

2、e,SVR)。因此,充分認識IFN-α抗病毒機制尤為重要。IFN-α直接抑制病毒復制外,還通過調(diào)節(jié)機體免疫活性清除HCV感染肝細胞,然而,IFN-α抗HCV免疫的潛在分子機制尚需進一步闡明。
　　機體免疫應答在抑制病毒復制和疾病進展中發(fā)揮著重要作用。自然殺傷細胞(natural killer cells,NK)作為機體固有免疫系統(tǒng)中的重要組分,通過細胞毒性和分泌抗病毒因子如,IFN-γ等,在早期控制病毒感染。在急慢性HCV感染過程

3、中,NK細胞參與了抗病毒免疫;多數(shù)學者認為,慢性HCV感染中NK細胞處于免疫抑制狀態(tài),機制尚未完全清楚。CD100,又稱Sema4D,組成性表達于NK細胞和靜息T細胞。作為粘附分子,CD100通過與受體結合,增強效應細胞與靶細胞間粘附,對NK細胞功能進行免疫調(diào)節(jié)。然而,目前尚無關于CD100在慢性HCV感染中研究的實驗室證據(jù)。
　　本研究選取75例慢性HCV感染者(未治療30例,應用標準化抗病毒治療后獲得早期病毒學應答者25例,獲

4、得SVR者20例)為研究對象。主要采用流式細胞術包膜染色檢測外周血NK細胞膜上CD100、CD69和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)表達水平;以及采用ELISA檢測血清中可溶性CD100(soluble CD100,sCD100)水平。體外觀察了HCV感染和IFN-α刺激對CD100及受體Plexin-B1/B2表達

5、影響,并通過阻斷CD100-Plexin-B1/B2結合,觀察NK細胞殺傷活性變化,探討IFN-α介導抗病毒免疫的潛在分子機制及作用模式。
　　主要研究內(nèi)容和方法:
　　1.慢性丙型肝炎患者NK細胞CD100表達及意義
　　有研究報道,在免疫缺陷病毒及漢坦病毒感染過程中,CD100參與了機體免疫調(diào)節(jié),但目前尚無HCV感染和CD100研究的相關報道。我們主要采用流式細胞術觀察了慢性HCV感染者(30例未治療患者)NK細胞

6、、亞群分布以及NK細胞膜分子CD100,CD69和TRAIL表達水平變化;同時,采用ELISA法檢測了慢性HCV感染者血清中sCD100水平。并采用Spearman相關檢驗分析了NK細胞膜分子與臨床指標,谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)及HCV RNA水平之間的相關性。
　　2.HCV及IFN-α對CD100及受體Plexin-B1/B2表達影響
　　病毒感染可誘導NK細胞活化性受體(N

7、KG2D等)的配體在靶細胞表達,促進NK細胞活化,發(fā)揮殺傷功能。眾所周知,IFN-α是抗HCV感染治療藥物的主要組分,但是其通過調(diào)節(jié)機體免疫發(fā)揮抗病毒作用的分子機制尚不清楚。因此,我們選用K562及Huh7.5細胞做為本部分實驗的靶細胞,首先采用qRT-PCR及流式細胞術檢測K562及Huh7.5細胞是否表達CD100受體,Plexin-B1/B2。然后,體外采用不同感染復數(shù)(1,10,100)的HCV及不同濃度(0.01,0.1,1,

8、10,100,1000ng/ml)的IFN-α分別刺激健康人外周血單個核細胞(PBMC)和Huh7.5細胞,在不同時間點觀察CD100及其受體Plexin-B1/B2表達水平的變化。
　　3.探索IFN-α調(diào)節(jié)NK細胞功能的分子作用機制
　　既往研究報道,IFN-α通過增強NK細胞功能,發(fā)揮抗HCV作用,但是相關分子機制尚不明確。我們首先采用流式細胞術觀察了接受 Peg-IFN-α聯(lián)合利巴韋林治療,獲得EVR及SVR者,外周

9、血NK細胞及亞群分布以及CD100,CD69及TRAIL在NK細胞表達變化;同時觀察了血清中sCD100水平變化,并分析了CD100,TRAIL與病毒學應答的關系。體外采用K562,Huh7.5及HCV感染的Huh7.5細胞作為靶細胞,與分離的健康人NK細胞共培養(yǎng)12h,在IFN-α刺激下,觀察NK細胞功能變化;同時采用CD100阻斷實驗,觀察 NK細胞毒性及細胞因子IFN-γ分泌變化,探索CD100與其受體結合在調(diào)節(jié)NK細胞殺傷靶細胞

10、過程中的作用。
　　主要研究結果如下:
　　1.慢性HCV感染者外周血中NK細胞亞群分布異常,表現(xiàn)為CD56dim NK亞群比率顯著下降,“失能”的CD56neg NK亞群異常增殖。
　　2.慢性HCV感染者血清中sCD100水平較健康對照者顯著降低;NK細胞CD100、CD69和TRAIL表達輕度異常,但無統(tǒng)計學差異。
　　3.慢性HCV感染者NK細胞CD100及TRAIL表達分別與谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平呈正相關,而與

11、HCV-RNA滴度呈負相關。
　　4.體外HCV感染及IFN-α治療均顯著影響CD100及其受體Plexin-B1/B2表達。
　　5.慢性HCV感染者經(jīng)過有效的IFN-α抗病毒治療后獲得EVR者,NK細胞CD100、CD69和TRAIL表達顯著上調(diào),sCD100血清水平升高;獲得SVR的患者,異常分布的NK細胞亞群、血清中sCD100及三種膜分子表達均恢復正常水平。
　　6.HCV可增強NK細胞毒性,表現(xiàn)為CD107

12、a表達升高,而對IFN-γ分泌無顯著影響;對不同靶細胞(K562、Huh7.5及HCV感染的Huh7.5細胞)應答過程中,IFN-α顯著增強NK細胞殺傷活性,包括毒性及細胞因子分泌功能。
　　7.阻斷CD100與Plexin-B1/B2結合,明顯抑制NK細胞功能,表現(xiàn)為CD107a及IFN-γ表達下調(diào)。
　　綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)HCV感染通過下調(diào)NK細胞CD100表達,降低效應細胞與靶細胞間接觸,抑制對靶細胞殺傷和病毒清除。根

13、據(jù)慢性HCV感染者CD100與ALT、HCV-RNA水平之間相關性,推測CD100可能參與了免疫介導的肝臟炎癥發(fā)生和病毒控制。在NK細胞對靶細胞免疫應答中,IFN-α治療通過上調(diào)CD100、TRAIL、CD107a和IFN-γ等分子表達,促使NK細胞活化,增強了對病毒感染肝細胞的殺傷,有助于清除HCV。探討其機制,發(fā)現(xiàn)CD100與受體Plexin-B1/B2結合在調(diào)節(jié)NK細胞功能中發(fā)揮了關鍵作用,為研制抗HCV感染新的藥物靶點提供了實驗