大鼠三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元對GABA的反應(yīng)及其相關(guān)發(fā)育學(xué)研究.pdf

1、眾所周知，γ-氨基丁酸(GABA)是廣泛分布于哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它可與相應(yīng)的GABA受體結(jié)合從而發(fā)揮相應(yīng)的生理功能。以往有諸多研究觀察到GABA能神經(jīng)終末圍繞在三叉神經(jīng)中腦核（mesencephalic trigeminal nucleus, Vme）神經(jīng)元的胞體周圍。本實驗組以往的研究也在超微結(jié)構(gòu)水平進(jìn)一步證實了GABA能神經(jīng)終末與Vme神經(jīng)元的胞體形成突觸聯(lián)系；同時在Vme神經(jīng)元胞體上還觀察到GAB

2、AARα1 和GABAARα3 受體亞型的表達(dá)。雖然已有文獻(xiàn)報道了腦片上Vme神經(jīng)元對GABA的興奮性反應(yīng)，但由于方法學(xué)的局限性，GABA在Vme神經(jīng)元內(nèi)的反應(yīng)及其可能的分子基礎(chǔ)仍不明確，負(fù)責(zé)氯離子轉(zhuǎn)運的陽離子-Cl-共轉(zhuǎn)運體可能參與該反應(yīng)過程，但相關(guān)的研究到目前為止尚未見報道。 陽離子-Cl- 共轉(zhuǎn)運體在維持細(xì)胞內(nèi)外Cl- 濃度的平衡方面發(fā)揮主要作用。 在目前報道的七種陽離子-Cl- 共轉(zhuǎn)運體中，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)僅表達(dá)K

3、CC1、KCC2、KCC3 和NKCC1 四種陽離子-Cl- 共轉(zhuǎn)運體。其中，KCC2 負(fù)責(zé)將神經(jīng)元內(nèi)Cl-向外轉(zhuǎn)運，而NKCC1 則負(fù)責(zé)將胞外的Cl- 向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，二者在神經(jīng)元胞膜上構(gòu)成一對平衡體，從而維持神經(jīng)元內(nèi)Cl-濃度的穩(wěn)定和平衡。生后發(fā)育過程中大鼠Vme神經(jīng)元內(nèi)KCC2 和NKCC1 的表達(dá)及其變化，到目前為止鮮見報道，而這種表達(dá)的變化可能與氯通道開放后的作用效果有密切聯(lián)系。 小白蛋白（Parvalbumin, PV

4、）是鈣結(jié)合蛋白的一種。已有研究表明：發(fā)育過程中，PV 特異性地表達(dá)于本體感覺初級傳入神經(jīng)元（如大的背根節(jié)和Vme 等）胞體和突起上。目前，PV 作為研究本體感覺初級傳入神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物已被廣泛應(yīng)用在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育學(xué)研究領(lǐng)域。此外，有關(guān)Vme的生后發(fā)育研究亦表明，PV 幾乎表達(dá)于所有的Vme 神經(jīng)元中。但是，NKCC1、KCC2 與PV 在Vme 的生后發(fā)育過程中是否有共存，其共存的比例是否有變化，而這種相對量上的變化與蛋白表達(dá)水平改

5、變的實際情況是否相符也無明確的答案。 基于此，本論文進(jìn)行了如下研究：(1) 運用機械分離帶終扣的單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對大鼠Vme 神經(jīng)元對GABA 的反應(yīng)進(jìn)行觀察；(2) 運用Westernblotting 技術(shù)結(jié)合圖像分析方法觀察生后發(fā)育過程中Vme 神經(jīng)元內(nèi)NKCC1和KCC2 的表達(dá)變化；(3) 運用免疫熒光組織化學(xué)雙重標(biāo)記技術(shù)對生后發(fā)育過程中Vme 神經(jīng)元內(nèi)NKCC1 和KCC2 與PV 之間的共存關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)觀眾所周知

6、，γ-氨基丁酸(GABA)是廣泛分布于哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它可與相應(yīng)的GABA受體結(jié)合從而發(fā)揮相應(yīng)的生理功能。以往有諸多研究觀察到GABA能神經(jīng)終末圍繞在三叉神經(jīng)中腦核（mesencephalic trigeminal nucleus, Vme）神經(jīng)元的胞體周圍。本實驗組以往的研究也在超微結(jié)構(gòu)水平進(jìn)一步證實了GABA能神經(jīng)終末與Vme神經(jīng)元的胞體形成突觸聯(lián)系；同時在Vme神經(jīng)元胞體上還觀察到GABAARα

7、1 和GABAARα3 受體亞型的表達(dá)。雖然已有文獻(xiàn)報道了腦片上Vme神經(jīng)元對GABA的興奮性反應(yīng)，但由于方法學(xué)的局限性，GABA在Vme神經(jīng)元內(nèi)的反應(yīng)及其可能的分子基礎(chǔ)仍不明確，負(fù)責(zé)氯離子轉(zhuǎn)運的陽離子-Cl-共轉(zhuǎn)運體可能參與該反應(yīng)過程，但相關(guān)的研究到目前為止尚未見報道。 陽離子-Cl- 共轉(zhuǎn)運體在維持細(xì)胞內(nèi)外Cl- 濃度的平衡方面發(fā)揮主要作用。 在目前報道的七種陽離子-Cl- 共轉(zhuǎn)運體中，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)僅表達(dá)KCC1、

8、KCC2、KCC3 和NKCC1 四種陽離子-Cl- 共轉(zhuǎn)運體。其中，KCC2 負(fù)責(zé)將神經(jīng)元內(nèi)Cl-向外轉(zhuǎn)運，而NKCC1 則負(fù)責(zé)將胞外的Cl- 向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，二者在神經(jīng)元胞膜上構(gòu)成一對平衡體，從而維持神經(jīng)元內(nèi)Cl-濃度的穩(wěn)定和平衡。生后發(fā)育過程中大鼠Vme神經(jīng)元內(nèi)KCC2 和NKCC1 的表達(dá)及其變化，到目前為止鮮見報道，而這種表達(dá)的變化可能與氯通道開放后的作用效果有密切聯(lián)系。 小白蛋白（Parvalbumin, PV）是鈣結(jié)

9、合蛋白的一種。已有研究表明：發(fā)育過程中，PV 特異性地表達(dá)于本體感覺初級傳入神經(jīng)元（如大的背根節(jié)和Vme 等）胞體和突起上。目前，PV 作為研究本體感覺初級傳入神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物已被廣泛應(yīng)用在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育學(xué)研究領(lǐng)域。此外，有關(guān)Vme的生后發(fā)育研究亦表明，PV 幾乎表達(dá)于所有的Vme 神經(jīng)元中。但是，NKCC1、KCC2 與PV 在Vme 的生后發(fā)育過程中是否有共存，其共存的比例是否有變化，而這種相對量上的變化與蛋白表達(dá)水平改變的實際

10、情況是否相符也無明確的答案。 基于此，本論文進(jìn)行了如下研究：(1) 運用機械分離帶終扣的單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對大鼠Vme 神經(jīng)元對GABA 的反應(yīng)進(jìn)行觀察；(2) 運用Westernblotting 技術(shù)結(jié)合圖像分析方法觀察生后發(fā)育過程中Vme 神經(jīng)元內(nèi)NKCC1和KCC2 的表達(dá)變化；(3) 運用免疫熒光組織化學(xué)雙重標(biāo)記技術(shù)對生后發(fā)育過程中Vme 神經(jīng)元內(nèi)NKCC1 和KCC2 與PV 之間的共存關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)觀察。本論文包括以

11、下三個部分的內(nèi)容： 第一部分 大鼠三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元對GABA 的反應(yīng) 本研究運用機械分離帶終扣的單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察Vme神經(jīng)元對GABA的反應(yīng)情況，結(jié)果如下：在鉗制電壓為-70 mV時，給予1 μM TTX、10 μM AP-5 和10 μM CNQX情況下，在所有被檢測的Vme神經(jīng)元上均記錄到內(nèi)向的mPSCs, mPSCs的平均幅值為24±20 pA，mPSC的反轉(zhuǎn)電位約為-30mV，與運用Nernst

12、方程計算出的Cl- 平衡電位相當(dāng)；同時給予GABAA受體特異性拮抗劑Bicuculline (5 μM )時，已觀察到的突觸前GABA所引起的電流被完全阻斷，洗脫后，GABA所引起的mPSCs恢復(fù)到先前水平。 以上結(jié)果表明：突觸前終扣內(nèi)釋放的GABA與分布于突觸后的GABAA受體結(jié)合從而發(fā)揮對Vme神經(jīng)元的調(diào)控作用，GABAA受體激活后，氯離子通道開放，Vme神經(jīng)元胞體內(nèi)外氯離子流動構(gòu)成了GABA對Vme神經(jīng)元的作用基礎(chǔ)。

13、 第二部分 大鼠生后發(fā)育過程中三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元內(nèi)NKCC1 和KCC2 的表達(dá)及其變化 本研究分別選取生后0、4、7、10、14、21 的正常雄性大鼠，應(yīng)用免疫組織化學(xué)及Western blotting 技術(shù)結(jié)合圖像分析對Vme 神經(jīng)元內(nèi)KCC2 和NKCC1 的表達(dá)變化進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示：（1）NKCC1 均表達(dá)于Vme 神經(jīng)元的胞體，突起上無表達(dá)；（2）生后0 天（P0）大鼠Vme 神經(jīng)元內(nèi)NKCC1已開始

14、表達(dá)，但表達(dá)相對較低，隨著發(fā)育時間的延長，NKCC1 的表達(dá)逐漸增強，至P10 時已達(dá)成年水平。運用Image-pro plus 軟件進(jìn)行灰度分析顯示，P0、P4、P7、P10、P14、P21 六個不同日齡大鼠Vme 內(nèi)NKCC1 的灰度值逐漸增大，P0、P4、P7 三個日齡表達(dá)水平分別與P10、P14、P21 三個日齡的表達(dá)水平相比較存在顯著性差異（P< 0.05）；而KCC2 的表達(dá)從P0 至P21時均較弱，各日齡間無差異（P> 0

15、.05）。 本部分研究結(jié)果表明在大鼠Vme 神經(jīng)元生后發(fā)育過程中，NKCC1 呈逐漸高水平表達(dá)，而KCC2 始終低水平表達(dá)，提示成年時Vme 神經(jīng)元胞體中氯離子濃度水平較高，推測胞內(nèi)氯離子濃度隨發(fā)育不斷增高可能與成年時GABA 對Vme 神經(jīng)元的作用密切相關(guān)。 第三部分 大鼠生后發(fā)育過程中三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元內(nèi)NKCC1、KCC2 與PV 的共存研究 本研究運用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)分別觀察了大鼠P4、P7

16、、P10、P14、P21五個時間點NKCC1、KCC2 與PV 的共存情況，并進(jìn)行了統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示：隨著發(fā)育，NKCC1 與PV 的共存率逐漸升高，到成年時NKCC1 幾乎表達(dá)于所有的Vme 神經(jīng)元上。而KCC2 在Vme 神經(jīng)元上幾乎觀察不到表達(dá)，在五個不同時間點，均未觀察到任何雙標(biāo)記神經(jīng)元。而在陽性對照實驗中，在小腦的蒲肯野氏細(xì)胞層能觀察到明顯的KCC2 的表達(dá)。本部分研究結(jié)果進(jìn)一步提示成年后NKCC1 高水平表達(dá)而KCC2 的