小兒急性白血病microRNA表達譜及miR-125b的功能研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA，其長度為19到25個核苷酸，在真核生物的多種發(fā)育和生理過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。研究表明，約有50％的已注釋人類的miRNA位于脆性位點和跟癌癥發(fā)生相關的基因區(qū)，并且起著腫瘤抑制基因和癌基因的功能。此外，在很多癌癥包括白血病中已經鑒定到與診斷、發(fā)展、預后及治療反應相關的miRNA表達譜。白血病是一種血液或骨髓的癌癥，是由血細胞的異常增殖引起的。小兒與成人白血病在臨床和生物學特

2、性、治療反應、治愈率以及造血系統(tǒng)惡性腫瘤類型等方面有著明顯的不同。同許多成人白血病的研究相比，小兒白血病相關miRNA的表達特點及功能研究較少。而且，能否用基于miRNA的方法來更加準確地診斷小兒白血病尚待研究。 在本研究中，我們總共收集了有臨床資料的212例小兒急性淋巴細胞白血病(ALL)和急性髓細胞白血病(AML)病例以及12例小兒正常對照樣品進行小兒急性白血病miRNA相關的研究，其中38例病例和7例對照用于miRNA芯片

3、分析，剩余174例樣品和5例正常對照用于qRT—PCR驗證及進一步的miRNA功能研究，獲得了如下重要結果： (1) MiRNA芯片結果揭示存在小兒白血病特異性的miRNA表達譜。我們首先對36例小兒急性白血病患者的576個人類成熟miRNA的表達譜進行了分析，篩選并獲得了一批小兒特異性表達的miRNA分子，如miR-125b、miR—34a、miR-18b、miR—28、miR—331、miR—505等，這些miRNA的表達與

4、成人明顯不同，揭示了小兒白血病中存在著與成人不同的、小兒特有的miRNA表達譜。進一步比較分析發(fā)現(xiàn)，在小兒ALL中特異高表達的miRNA有miR—34a、miR-128a、miR-128b和miR-146a，而在小兒AML中特異高表達的miRNA是miR-100、miR-125b、miR—335、miR-146a和miR—99a等，表明miRNA表達譜可以區(qū)分小兒ALL和小兒AML。在miRNA表達譜分析的基礎上，我們結合臨床資料分析獲

5、得了跟小兒ALL危險度、中樞神經系統(tǒng)(CNS)復發(fā)相關、強的松反應以及小兒ALL復發(fā)相關的miRNA表達模式，這些表達譜為小兒個體化治療提供新的思路。 (2) MiRNA表達譜與小兒AML的分型和預后有關。AML是一種急性髓細胞白血病，可以根據細胞發(fā)育和成熟程度分為M0到M7八個亞型。采用非監(jiān)督聚類方法對miRNA芯片進行分析，結果表明，miRNA表達譜可以有效區(qū)分M1、M2和M3亞型，部分特異性表達的miRNA分子進一步得到q

6、RT—PCR結果的驗證，如miR—335在M1中高表達，miR-126在M2中高表達，而miR-125b則在M3(又稱為acute promyelocytic leukemia APL)中高表達。值得注意的是，miR-125b在APL中的表達上調約200倍，遠遠高于AML其它亞型，暗示了miR-125b可能在小兒APL的發(fā)生中起著重要的作用。本研究又進一步在大量的APL臨床樣本中對miR-125b的表達進行了檢測，其中包括82例小兒AP

7、L初發(fā)患者、33例完全緩解(CR)樣品、3例未緩解(NR)樣品及4例復發(fā)樣品。結果表明，miR-125b在所有82例小兒APL亞型初發(fā)患者中顯著高表達，在90％的治療后緩解樣品中的表達量下降，幾乎與正常對照中的表達相同，而在未緩解患者中盡管比治療前稍低但仍然比正常對照高。這些結果揭示了miR-125b參與了APL的發(fā)生，可以用來評估預后和化療效果。 (3) MiR-125b通過調控靶基因BAK1發(fā)揮了癌基因功能。為了進一步研究m

8、iR-125b的功能，我們又運用TargetScan軟件對miR-125b的靶基因進行了預測，選擇了幾個可能的靶基因。通過雙熒光報告轉染實驗，我們證實了BAK1就是miR-125b的靶基因。BAK1屬于BCL2蛋白家族，其功能是誘發(fā)細胞的凋亡。對122例APL患者進行Western blot分析，結果表明，在正常對照和60％的CR樣本中BAK1蛋白表達較高，miR-125b表達較低，而在70％的未治療和所有NR的APL患者中BAK1蛋白

9、表達較低，miR-125b表達較高，表明在APL患者中miR-125b的表達與其靶基因BAK1蛋白的表達呈負相關，調控了BAK1蛋白的表達。此外，用100nM miR-125b mimics轉染NB4細胞后BAK1的表達明顯降低，而且MTT實驗表明miR-125b明顯促進了NB4細胞的增殖。這些結果有力地揭示了miR-125b在APL中起著癌基因的作用，能夠促進APL的發(fā)展，該研究不僅闡明了小兒APL新的致病機制，而且還為以miR-12