黃連生物堿抗結腸癌作用實驗及其分子機制研究.pdf

1、目的：觀察黃連總堿和小檗堿對結腸癌的防治作用，并探討其可能的作用機制。 方法： 1．采用1-2 dimethylhydrazine(DMH)皮下注射(sc)+1％的dextransodium sulfate(DSS)水溶液飲用誘導形成大鼠結腸癌模型。實驗分6組：(1)．模型組(DMH 40 mg/kg+DSS；(2)．美洛昔康小劑量組(DMH+DSS+0.45mg/kg)；(3)．美洛昔康大劑量組(DMH+DSS+1.3

2、5 mg/kg)：(4)．黃連總堿小劑量組(DMH+DSS+120 mg/kg)；(5)．黃連總堿大劑量組(DMH+DSS+360mg/kg)；(6)．小檗堿組(DMH+DSS+100mg/kg)。每組各25只大鼠。觀察各組藥物對誘瘤后第10 wk大鼠結腸ACF數(shù)量、第20 wk對大鼠結腸癌的發(fā)生率及體重變化的影響。應用美藍染色法觀察ACF數(shù)量，HE染色法進行形態(tài)學觀察和病理定性分析。 2．培養(yǎng)人結腸癌lovo細胞，給予不同濃度

3、黃連總堿、小檗堿、美洛昔康和羅格列酮(10<'-6>mol/1、10<'-5>mol/l、10<'4>mol/l、10<'-3>mol/l)，作用細胞6 h、12h和24 h后，應用四甲基谷氮藍實驗(MTT)觀察對lovo細胞增殖的影響。 3．培養(yǎng)人結腸癌lovo細胞，給予小檗堿(10<'-5>mol/l)+或不+GW9662(10<'-7> mol/l)和羅格列酮(10<'-5>mol/l)+或不+GW9662(10<'-7>

4、mol/l)分別作用24h后，應用MTT法觀察對lovo細胞增殖的影響。 4．采用逆轉錄聚合酶鏈反應(Reverse transcription ploymerse chain reaction，RT-PCR)檢測各用藥組細胞COX-2、PPARTmRNA表達水平。 5．采用蛋白質免疫印跡法(Western blot)檢測各用藥組細胞COX-2、PPARγ蛋白表達水平。 結果： 1．黃連生物堿對DMH+D

5、SS處理大鼠生長發(fā)育的影響黃連生物堿可以明顯改善DMH+DSS誘癌過程中大鼠的惡液質狀態(tài)，阻斷體重減輕。 2．黃連生物堿對DMH+DSS誘導大鼠ACF的影響實驗第10 wk，模型組大鼠誘導出ACF19.2±3.5，數(shù)量明顯高于各藥物干預組。黃連總堿大、小劑量組對ACF的形成呈現(xiàn)出劑量依賴性抑制(P<0.05)；與黃連總堿小劑量相當?shù)男￠迚A組ACF平均數(shù)量明顯低于模型組(P<0.01)；陽性對照美洛昔康大、小劑量組對ACF的形成也

6、呈現(xiàn)出劑量依賴性抑制(P<0.05)；黃連大劑量組、美洛昔康大劑量組和小檗堿組組間比較ACF形成數(shù)量沒有明顯差異。 3．黃連生物堿對DMH+DSS誘導大鼠結腸癌的影響實驗第20wk，模型組結腸癌發(fā)生率為80％，明顯高于各藥物干預組(P<0.01)；黃連總堿大小劑量組的誘癌率分別為33.3％、25％；與黃連總堿小劑量組相當?shù)男￠迚A組誘癌率與其相同為33.3％；陽性對照美洛昔康大小劑量組的誘癌率分別為40％、26.7％。組間比較無明

7、顯差異。 4．黃連生物堿對lovo細胞增殖的抑制作用及其與PPARγ、COX-2的關系黃連總堿、小檗堿在濃度大于10<'-5>mol/l，陽性對照藥物羅格列酮在濃度大于10<'-5>mol/l、美洛昔康在濃度大于10<'-4>mol/l明顯抑制lovo細胞增殖，誘導凋亡，且呈濃度和時間依賴性。黃連總堿、小檗堿、美洛昔康和羅格列酮對lovo細胞作用24 h IC<,50>分別為3.21±0.1μmol/l、2.83±0.2μmol

8、/l、4.99±0.17μmol/l和3.14±0.135μmol/l。 PPARγ特異性阻斷劑GW9662預處理細胞后，羅格列酮對細胞的抑制作用明顯減弱(P<0.01)，但是對小檗堿誘導細胞凋亡的作用沒有影響。小檗堿和羅格列酮能濃度依賴性地降低lovo細胞中COX-2和PPARTmNRA表達，對COX-2蛋白表達也呈濃度依賴性抑制，但是對PPAγ蛋白表達沒有顯著影響。PPARγ特異性阻斷劑GW9662預處理細胞后，逆轉了羅格列

9、酮對COX-2 mRNA和蛋白的抑制表達作用。 結論： 1．黃連生物堿能抑制大鼠誘癌早期ACF的形成和腫瘤發(fā)生率。對DMH+DSS誘導的大鼠結腸癌有明顯的化學預防作用。 2．黃連生物堿能抑制人結腸癌lovo細胞增殖，誘導凋亡。與小檗堿和陽性藥物比較黃連總堿作用最為明顯，這可能與黃連總堿中含有其他生物堿有關。 3．PPARγ特異性阻斷劑GW9662不能逆轉小檗堿誘導lovo細胞凋亡的作用，提示小檗堿的抗腫瘤