急性血栓性疾病血栓標志物的探索性研究.pdf

1、血栓性疾?。═hrombotic diseases）是涉及臨床各科的一大類疾病。動脈粥樣硬化及其血栓栓塞性并發(fā)癥在我國和西方國家均已成為人口死亡與致殘的第一位原因，且呈逐年上升趨勢。血栓的發(fā)生是一個較為長期的過程，患者就醫(yī)時，血栓往往已經(jīng)形成并導致血管栓塞。心臟和腦等對缺血十分敏感的器官，發(fā)生栓塞后治療效果不佳，故血栓性疾病嚴重危害人類健康。如能在血栓發(fā)生的早期即進行診斷并及時采取干預措施，則能夠大大降低血栓栓塞性疾病的危害。
　

2、　 目前，血栓性疾病的確診主要依靠血栓形成部位的影像學證據(jù)。臨床上主要以D-二聚體(d-dimer)、活化部分凝血酶原時間(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)bg)含量等作為血栓性疾病的初步篩查項目，其敏感度和準確性尚無統(tǒng)一的臨床結(jié)論。血栓性疾病發(fā)病機制極其復雜，在血栓形成早期，或血栓尚未形

3、成時，上述篩查指標可能出現(xiàn)陰性結(jié)果，往往延誤正確判斷；而當陽性結(jié)果出現(xiàn)時，疾病往往已進展到中晚期，失去了最有效的治療時機。因此，在血栓病高危人群中，對血栓發(fā)生危險性進行全面的評估及早期診斷血栓形成已成為當今血栓病研究領(lǐng)域的熱點。
　　 蛋白質(zhì)-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（Time of flight mass spectrometry，TOF-MS）是蛋白質(zhì)組學中一種大規(guī)模、高通量的分子研究方法，與生物信息學和基因功能實驗等相結(jié)合已經(jīng)在揭

4、示疾病發(fā)生的分子機制領(lǐng)域中發(fā)揮越來越重要的作用。本試驗采用表面增強激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜儀（surface enhanced laser desorption/ionization time offlight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）及蛋白質(zhì)生物芯片技術(shù)探索性研究動脈、靜脈血栓形成患者的血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜，旨在發(fā)現(xiàn)能夠區(qū)分血栓病與對照組的高敏感、高特異的蛋白質(zhì)生物標志物，為開發(fā)新的可用于診斷血栓

5、形成的特異性標記物提供實驗依據(jù)。同時，結(jié)合一系列與凝血、抗凝及纖溶系統(tǒng)相關(guān)的液態(tài)基因芯片檢測平臺及相關(guān)生化指標檢測，通過臨床研究，為發(fā)現(xiàn)血栓形成建立快速、準確的早期診斷綜合體系。
　　 第一部分：急性腦梗死凝血功能變化及其危險因素評估的回顧性研究
　　 目的：已有研究表明，血液中凝血、抗凝或纖溶蛋白水平的改變與腦血管疾病的發(fā)生明顯相關(guān)。但較少研究綜合考慮其在腦血管疾病中的改變及作用。在本次研究中，我們系統(tǒng)探討了其中的16

6、個凝血指標、血脂水平、以及其他可能的危險因素與急性腦梗死的關(guān)系。
　　 方法:武漢協(xié)和醫(yī)院急性腦梗死（Acute Cerebral INFarction，ACI）住院患者50例，住院對照54例。所有研究對象均在入院第二天清晨空腹采取肘靜脈血。血漿蛋白C（protein C，PC）、游離蛋白S（free protein S，F(xiàn)PS）、總蛋白S（total protein S，TPS）、凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，

7、TM）、活化凝血因子VII（activated factor VII,FVIIa）、凝血因子VII 抗原（factor VII antigen，F(xiàn)VII Ag）、P-選擇素（p-selectin）、組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plasminogen activator，t-PA）及纖溶酶原激活劑抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）水平均由ELISA 試劑盒檢測；組

8、織因子活性（tissue factor activity，aTF）由發(fā)色底物法檢測；全自動凝血分析儀（SysmexCA-7000,日本）檢測活化蛋白C（activated protein C，APC）比率、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時間(prothrombin time,PT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原(fibr

9、inogen,Fbg）以及D-二聚體(d-dimer）；檢驗科自動生化分析儀（日立7170A，東京，日本）檢測血脂水平。
　　 結(jié)論:高血壓，血漿凝血酶調(diào)節(jié)蛋白、纖維蛋白原水平及組織因子活性的升高是急性腦梗死的獨立危險因素。
　　 第二部分：急性深靜脈血栓形成危險因素的評估
　　 目的：觀察急性下肢深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）患者凝血功能變化及評估其危險因素。
　　

10、 方法：全自動凝血分析儀（Sysmex CA-7000，日本）檢測62例急性下肢DVT 患者和70例健康對照者血漿活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT）、凝血酶原時間(prothrombin time，PT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)bg）及D-二聚體(d-dimer）水平；檢驗科自動生化分析儀（日立717

11、0A，東京，日本）檢測高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、總膽固醇（total cholesterol，TC）及甘油三酯（triglyceride，TG）水平；并通過二分類邏輯回歸分析回顧性研究所有患者的臨床資料。
　　 結(jié)論：高血壓和升高的血漿纖維蛋白

12、原是急性下肢DVT的獨立危險因素。
　　 第三部分：急性血栓性疾病血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜研究
　　 實驗一、急性腦梗死血漿潛在標志物的蛋白質(zhì)組學研究
　　 目的：既往研究表明，并不存在單一的生化指標可用于急性腦梗死（Acute CerebralINFarction，ACI）的常規(guī)診斷。本實驗運用表面增強激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜(Surface-enhanced laser desorption/ionizatio

13、n time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS）技術(shù)篩選急性腦梗死患者血漿中潛在的特異標志物。
　　 方法：入選急性腦梗死患者32例，健康對照者60例。采用SELDI-TOF-MS 及弱陽離子交換芯片陣列技術(shù)（weak cation exchange CM10 ProteinChip arrays，CiphergenBiosystems）檢測兩組研究對象的血漿蛋白質(zhì)質(zhì)譜；并借助生物

14、信息學工具（非線性的支持向量機，nonlinear support vector machine）提出急性腦梗死的診斷模型,并運用留一交叉驗證法（Leave-one-out cross validation）來評估該模型的判別效能。
　　 結(jié)論：SELDI-TOF-MS 及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在急性腦梗死的診斷中具有潛在的應用前景。急性腦梗死的診斷可能依賴于一組生物標志物的結(jié)合。
　　 實驗二、急性心肌梗死及深靜脈血栓形成血漿

15、潛在標志物的蛋白質(zhì)組學研究
　　 目的：本研究運用表面增強激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜(Surface enhanced laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）技術(shù)來尋找血栓栓塞性疾病（動脈和靜脈）的特異生物標志物。
　　 方法：篩查了69例血漿樣本中的潛在生物標志物，其中包括20例特發(fā)性深靜脈血栓形成（Deep

16、vein thrombosis，DVT）、20例急性心肌梗死（Acute myocardialiNFarction，AMI）患者以及29例既往無血栓栓塞疾病史的健康對照者。在蛋白質(zhì)生物系統(tǒng)Iic 及SELDI-TOF-MS（Ciphergen Biosystems，F(xiàn)remont，CA）上分析預先處理過的血漿樣品。并運用銅離子活化的固定金屬鰲合親和層析芯片陣列（immobilized metalaffinity chromatograp