低濃度葡萄糖對體外培養(yǎng)人椎間盤髓核細胞形態(tài)、生長和凋亡的影響.pdf

1、導致椎間盤退變的因素很多，而椎間盤的營養(yǎng)供應減少是其中的因素之一。椎間盤是人體最大的無血管組織，營養(yǎng)供應相對缺乏。椎間盤營養(yǎng)通過軟骨終板和纖維環(huán)這兩條途徑擴散入椎間盤內，而椎間盤內髓核細胞的營養(yǎng)主要通過終板途徑獲得營養(yǎng)。隨著年齡逐漸增加，軟骨終板逐漸變薄、鈣化，軟骨終板的血管數量也就逐漸減少。髓核細胞營養(yǎng)供應相對缺乏，從而導致髓核細胞數量減少，最終導致椎間盤退變。葡萄糖是椎間盤髓核細胞的營養(yǎng)成分之一，葡萄糖是通過糖酵解的方式向椎間盤提供

2、能量的，故椎間盤需要消耗大量的葡萄糖。在椎間盤軟骨終板鈣化的情況下，軟骨終板限制了葡萄糖的通過，導致椎間盤髓核內葡萄糖濃度降低，進而導致髓核細胞活性降低和凋亡增加。本實驗目的旨在研究低濃度葡萄糖對體外培養(yǎng)髓核細胞形態(tài)、生長及凋亡的影響，為椎間盤退變的病因學研究提供依據。
　　一、人椎間盤髓核細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　人髓核組織取自脊柱側彎矯形手術患者，年齡在10-15歲，術前MRI檢查證實椎間盤信號與正常椎間盤信號一致。所

3、取標本在超凈臺上仔細分離出韌帶、纖維環(huán)和軟骨終板，剪碎髓核組織。0.25％的胰蛋白酶消化約40min。0.2％Ⅰ型膠原酶和0.2％Ⅱ型膠原酶混勻消化約3h，待髓核組織變成絮狀物質后，用DF12+10％FBS終止消化。離心，去除組織殘渣，加入DF12+15％FBS培養(yǎng)液。細胞接種于培養(yǎng)瓶中，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中觀察細胞形態(tài)學變化；MTT法繪制細胞生長曲線；甲苯胺藍染色觀察細胞形態(tài)；GAG和Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定細胞表型。結果：

4、GAG染色和Ⅱ型膠原染色對細胞進行鑒定所得細胞為髓核細胞，甲苯胺藍染色觀察細胞形態(tài)正常，MTT法繪制生長曲線顯示細胞生長良好。結論：胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶混合培養(yǎng)法所得髓核細胞形態(tài)正常，細胞生長良好，表型表達為髓核細胞，滿足椎間盤體外實驗研究。
　　二、不同葡萄糖濃度的細胞培養(yǎng)液對體外培養(yǎng)椎間盤髓核細胞形態(tài)、生長和凋亡的作用
　　實驗中的髓核細胞為實驗一中培養(yǎng)的細胞。實驗分為四組：加入葡萄糖濃度為5mmol/L的培

5、養(yǎng)液組(對照組)；加入葡萄糖濃度為2.5mmol/L的培養(yǎng)液組；加入葡萄糖濃度為1mmol/L的培養(yǎng)液組；加入葡萄糖濃度為0mmol/L的培養(yǎng)液組。MTT法繪制生長曲線；培養(yǎng)48h和72h后，相差顯微鏡觀察髓核細胞形態(tài)變化；透射電鏡下觀察細胞超微結構變化；流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果可以看到，隨著培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的不斷降低，細胞數量也逐漸減少。這說明過低的葡萄糖濃度細胞培養(yǎng)液可抑制髓核細胞的增殖。對照組中，細胞呈多角形或短梭形。超微

6、結構顯示，細胞核為橢圓形，核膜完整，有1-3個大小不等的核仁。粗面內質網輕度擴張，線粒體結構正常。在2.5mmol/L組、1mmol/L組、0mmol/L組中，倒置顯微鏡下均可見到大量的長梭形細胞，胞質減少，折光性減弱等細胞衰老跡象。2.5mmol/L組、1mmol/L組中，透射電鏡可觀察到髓核細胞內大量溶酶體和脂肪滴，濃縮的核染色質邊聚。0mmol/L中，透射電鏡觀察細胞內超微結構變化為，胞質內粗面內質網數目明顯減少，細胞器破壞，胞膜