熱應激對體外培養(yǎng)人黑素細胞生長及黑素合成的影響.pdf

1、目的:
　　人類皮膚的顏色主要靠表皮中黑素細胞（MC）合成黑素以及黑素傳遞至周圍角質(zhì)形成細胞（KC）來維持。如果黑素細胞合成和傳遞黑素的功能出現(xiàn)異常，就會導致各種皮膚色素性疾?。ㄈ纾喊遵帮L、黃褐斑等）的發(fā)生。因此研究影響黑素細胞合成和傳遞黑素的因素及其機制，對于預防和治療色素性皮膚病具有十分重要的臨床意義。
　　皮膚暴露于日光下可引起皮膚曬黑，既往的研究認為這些改變主要與紫外線（ultraviolet,UV）,尤其是中波紫外

2、線（ultraviolet B,UVB）有關。但近來，越來越多的證據(jù)表明日光中主要的能量物質(zhì)—熱（紅外線）對皮膚具有類似UV的作用，同時熱（紅外線）還可增加皮膚細胞對UV的耐受性。上個世紀末，Nakazawa等首先比較了人表皮MC對兩種外源性刺激UVB和熱的細胞反應，結果發(fā)現(xiàn)：熱（42℃,60min）和UVB（20mJ/cm2）輻射處理純化培養(yǎng)的人表皮MC3d后，MC樹突增多延長、包體增大，細胞的酪氨酸酶活性和黑素合成增加、增值率下降。

3、同時還發(fā)現(xiàn)熱和UVB均能促進KC-MC共培養(yǎng)體系和組織工程皮膚中有功能的活性MC數(shù)量增加，所以作者認為熱與UVB具有類似的MC生理調(diào)節(jié)作用。但后來Kim等人報道了一個相反的結果，他們發(fā)現(xiàn)熱以溫度依賴方式分別減少了小鼠MC系Mel-Ab和人表皮MC的黑素合成。
　　為了進一步明確熱對黑素細胞生理功能的調(diào)節(jié)作用，本實驗利用體外培養(yǎng)正常人表皮黑素細胞研究了熱應激對黑素細胞的增殖活性、細胞形態(tài)、黑素合成及酪氨酸酶活性的影響，并初步從蛋白層

4、面上探討了熱休克蛋白72（HSP72）和p53在熱應激引起黑素細胞功能變化中的作用。
　　方法:
　　1.無菌操作獲取正常人包皮環(huán)切術后的包皮，按照皮膚表皮細胞培養(yǎng)法獲取黑素細胞；利用堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)為主要有絲分裂原建立正常人表皮黑素細胞培養(yǎng)系，采用Masson-Fontana染色法對培養(yǎng)細胞進行鑒定，確定細胞種系。
　　2.采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定不同溫度(39℃、41℃、42℃、43

5、℃、45℃)的熱應激對黑素細胞活力的影響并選擇最佳的溫度劑量作為實驗條件進行后續(xù)實驗。
　　3.比較正常溫度（37℃）與最佳實驗溫度熱應激下的黑素細胞形態(tài)、酪氨酸酶活性和黑素含量的變化；并利用Western-bloting和RT-PCR技術比較正常溫度和熱應激條件下黑素細胞中HSP72和p53的蛋白和基因表達水平的變化。
　　4.所獲得的數(shù)據(jù)結果經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。
　　結果:
　　1.黑素細胞在

6、熱應激干預后細胞形態(tài)較干預前胞體增大，樹突明顯增多、變短呈多極化，樹突上明顯可見樹枝狀分叉，電子顯微鏡顯示：實驗組細胞胞漿中黑素小體數(shù)量較對照組有所增加，黑素小體中黑素更加致密。實驗組與對照組細胞的超微結構均較完整，未見明顯的細胞器破壞。
　　2.體外培養(yǎng)的正常人黑素細胞（MC）在42℃每天干預1h,連續(xù)干預3d的熱應激條件下，細胞的黑素合成量為0.152±0.005，較正常對照組（0.086±0.005）有明顯增加，增長率為78

7、％（t=24.81，P<0.01）；相同條件下實驗組細胞的酪氨酸酶活性為0.193±0.004，較正常對照組（0.142±0.011）亦有明顯增加，增長率為36.4％（t=9.34，P<0.01）。
　　3.體外培養(yǎng)的正常人黑素細胞（MC）在42℃每天干預1h,連續(xù)干預3d的熱應激條件下，細胞在末次干預后6h、12h和24h的HSP72和p53的蛋白表達均高于對照組，末次干預后12小時的HSP72和p53的基因表達也均高于對照組。

8、
　　結論:
　　本次實驗結果顯示：42℃的熱應激條件下，體外培養(yǎng)的正常人MC的細胞狀態(tài)明顯好于正常對照組，并且其細胞的各項生物學活性較正常對照組亦明顯增強，這表明熱應激對體外培養(yǎng)的正常人MC生物功能起著一定的正向調(diào)節(jié)作用。HSP72和p53蛋白在熱應激狀態(tài)下表達較正常對照組升高，提示我們這兩種蛋白分子可能在熱應激引起MC生物活性增強的過程中起著重要的調(diào)控作用。這為進一步研究熱應激調(diào)節(jié)人表皮MC生長和黑素合成的作用機制提供了