CUL4B通過抑制p53-ROS正反饋環(huán)減緩壓力誘導(dǎo)的細胞衰老.pdf

1、p53是重要的抑癌基因，50％以上的人類腫瘤中該基因存在突變，并且純合敲除p53的小鼠可自發(fā)多種腫瘤。該基因編碼的蛋白半衰期很短，使該蛋白維持較低的表達水平，多種壓力刺激均可激活p53，使該蛋白半衰期延長?；钚匝?ROS)是細胞有氧代謝所產(chǎn)生的一類含氧化合物的總稱，包括羥自由基(.OH)、超氧陰離子(O2.-)、過氧化氫(H2O2)以及其他多種過氧化物。ROS可作為細胞信號傳導(dǎo)的第二信使，參與調(diào)控多種細胞生理過程。
　　抑癌基因p

2、53可以調(diào)控ROS水平。生理條件或短暫輕度的壓力刺激下，p53可緩解氧化壓力發(fā)揮抗氧化作用，而較強和持續(xù)的壓力刺激下p53將加劇氧化壓力發(fā)揮促氧化作用。p53發(fā)揮抗氧化或是促氧化作用的機制主要是通過調(diào)控其下游氧化還原相關(guān)基因。CDKN lA，PIG3，PUMA，BAX，GPX1等一系列p53靶基因均可在一定壓力刺激下調(diào)控細胞內(nèi)ROS水平。
　　E3泛素連接酶復(fù)合物的骨架蛋白CUL4B在多種生物進程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，包括細胞周期，

3、DNA復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄。CUL4B在多種腫瘤中表達上調(diào)并具有明顯的促癌作用。但其對細胞衰老的影響尚不清楚。強烈壓力刺激后衰老和凋亡是細胞的兩種重要命運走向。而這種走向在不同的細胞中往往存在傾向性，例如宮頸癌細胞HeLa，人類腎上皮細胞HEK293等往往容易走向凋亡而人類成骨肉瘤細胞U2OS和正常人類成纖維細胞NHF則更容易走向衰老。為了探討CUL4B在細胞衰老中發(fā)揮的作用，我們利用人類成骨肉瘤細胞U2OS和正常人類成纖維細胞NHF進行了實

4、驗研究。結(jié)果表明CUL4B在壓力誘導(dǎo)的早衰細胞中存在蛋白水平的顯著下調(diào)并且這種下調(diào)促進壓力誘導(dǎo)的細胞衰老進程。
　　p53可調(diào)控細胞活性氧水平，而細胞內(nèi)活性氧水平的改變同樣可影響p53的激活，提示細胞內(nèi)可能存在p53-ROS反饋環(huán)。較強或持續(xù)壓力刺激下p53發(fā)揮促氧化作用，p53激活后可通過影響CDKN lA，PIG3等一些促氧化基因上調(diào)細胞內(nèi)活性氧水平;同時細胞內(nèi)ROS水平的升高可通過激活A(yù)TM進一步激活p53通路。此時細胞內(nèi)存

5、在強大的p53-ROS正反饋環(huán)，持續(xù)的信號反饋激活后最終引起壓力誘導(dǎo)的細胞衰老或細胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)在我們的研究體系中p53-ROS正反饋環(huán)調(diào)控壓力誘導(dǎo)的細胞衰老，而CUL4B正是通過抑制這一正反饋環(huán)的信號激活減緩了壓力誘導(dǎo)的細胞衰老。
　　我們發(fā)現(xiàn)氧化壓力刺激后CUL4B能促進p53泛素化，進而促進了p53的蛋白降解過程。氧化壓力刺激后，CUL4B缺失將引起p53半衰期的延長而CUL4B過表達則引起p53半衰期的縮短，并且我們在N

6、HF細胞中檢測到CUL4B蛋白與p53蛋白的直接結(jié)合，進一步的泛素化實驗也顯示壓力刺激下CUL4B能促進p53的泛素化。
　　綜上所述，我們的結(jié)果表明壓力刺激后CUL4B蛋白表達量顯著下調(diào)，這種下調(diào)抑制了p53的泛素化降解從而延長了p53的半衰期，進而造成了p53-ROS正反饋環(huán)的持續(xù)激活，最終抑制細胞增殖促進壓力誘導(dǎo)的細胞衰老;CUL4B過表達后，經(jīng)壓力刺激時p53泛素化降解加快半衰期縮短，從而顯著抑制p53-ROS正反饋環(huán)的激

7、活，進而促進細胞增殖減緩壓力誘導(dǎo)的細胞衰老。我們的研究推進了對p53在壓力誘導(dǎo)細胞衰老過程中的作用以及其上游調(diào)控機制的認識。
　　第一部分 CUL4B在壓力誘導(dǎo)的早衰細胞中表達下調(diào)
　　Cullin家族是目前已知最大的一類E3泛素連接酶，其中CUL4B是該家族的重要成員。CUL4B在多種表觀修飾和生物學(xué)進程中發(fā)揮重要作用。該基因在多種腫瘤組織中過表達并促進腫瘤細胞惡性程度，而CUL4B低表達的腫瘤細胞則表現(xiàn)為增殖減緩，細胞惡

8、性程度降低。此外，CUL4B在表觀調(diào)控方面抑制了一些衰老相關(guān)基因的表達，例如p16和CXCR2，由此我們推測CUL4B在細胞衰老過程中可能發(fā)揮作用。為此，我們首先檢測了CUL4B在多種類型衰老細胞中的表達變化情況。結(jié)果表明CUL4B在壓力誘導(dǎo)的早衰細胞（電離輻射，H2O2或羥基脲誘導(dǎo)的早衰細胞）中蛋白表達水平下調(diào)而在端?？s短引起的復(fù)制衰老細胞中蛋白表達水平不變。并且我們進一步在小鼠耳朵成纖維細胞(MSF)中檢測了CUL4B的蛋白表達情況

9、，結(jié)果表明這種經(jīng)受較強氧化壓力的小鼠細胞衰老后CUL4B的蛋白表達水平同樣顯著下調(diào)。值得一提的是壓力誘導(dǎo)早衰細胞中CUL4B蛋白水平的下調(diào)并沒有伴隨轉(zhuǎn)錄水平的改變，因此CUL4B的蛋白表達下調(diào)不是由于轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)引起的，這種蛋白水平的顯著下調(diào)可能是通過蛋白降解或microRNA的調(diào)控實現(xiàn)的。
　　第二部分 CUL4B抑制壓力誘導(dǎo)的細胞早衰
　　伴隨細胞衰老會有一系列基因表達水平的改變，這些改變可能是衰老發(fā)生的一部分原因也可能

10、是衰老發(fā)生后的一種結(jié)果。通過第一部分結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)壓力誘導(dǎo)細胞早衰后CUL4B蛋白水平顯著下調(diào)，但我們并不清楚這種下調(diào)是細胞衰老的原因還是結(jié)果。為了解開這一疑惑，我們構(gòu)建了CUL4B低表達和過表達的細胞系，并利用這些細胞系進行了一系列的壓力刺激后早衰情況的檢測。結(jié)果表明壓力刺激后CUL4B低表達細胞的衰老染色陽性比例顯著升高而BrdU摻入比例顯著降低;與此相對應(yīng)的是CUL4B過表達細胞的衰老染色陽性比例顯著降低而BrdU摻入比例顯著升高，

11、即CUL4B低表達顯著促進細胞早衰而CUL4B過表達則顯著減緩細胞早衰。與以上結(jié)果相對應(yīng)的是CUL4B在復(fù)制衰老中不存在蛋白水平的顯著下調(diào)，其表達水平的改變也不會影響復(fù)制衰老。此外，Cul4b敲除小鼠的耳朵成纖維細胞相對于野生型小鼠的耳朵成纖維細胞在氧化壓力下更容易衰老。而CUL4B轉(zhuǎn)基因小鼠的耳朵成纖維細胞相對于對照細胞對細胞早衰有顯著的抵抗作用。并且CUL4B表達情況的改變不影響壓力誘導(dǎo)的細胞凋亡。綜上所述，CUL4B表達水平顯著影

12、響壓力誘導(dǎo)的細胞衰老進程。
　　第三部分 CUL4B對p53-ROS正反饋環(huán)的負調(diào)控
　　抑癌基因p53是細胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，壓力刺激后p53可被磷酸化激活，這種活性狀態(tài)的p53進入細胞核并結(jié)合到靶基因的啟動子處調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性。其下游靶基因中包含大量的抗氧化及促氧化相關(guān)基因。較為緩和的壓力刺激下，p53可通過下游抗氧化基因發(fā)揮抗氧化作用;而強烈壓力刺激下p53通常通過下游促氧化基因發(fā)揮促氧化作用。p53野生細胞受MDM

13、2拮抗劑Nutlin-3處理后細胞ROS水平顯著升高，而p53缺失后這一升高現(xiàn)象被完全抑制。這一現(xiàn)象表明p53可通過調(diào)控這些氧化還原相關(guān)基因的表達而調(diào)控ROS的水平?；钚匝?ROS)是細胞正常代謝的一種產(chǎn)物，細胞維持一定水平的ROS也是維持細胞增殖所必須的，但是過高水平的ROS會引起細胞強烈的應(yīng)激反應(yīng)并使細胞走向衰老或凋亡。ROS可通過激活A(yù)TM而進一步激活p53通路，因此細胞內(nèi)存在p53-ROS反饋環(huán)。強烈壓力刺激下，p53-ROS正

14、反饋環(huán)會使信號持續(xù)激活從而促進細胞衰老或凋亡。為了探究CUL4B抑制細胞早衰的調(diào)控機制，我們用雙氧水和Nutlin-3分別處理CUL4B低表達及過表達的細胞48小時，之后對細胞的ROS水平及p53的激活水平進行檢測。結(jié)果顯示壓力刺激后CUL4B低表達細胞活性氧水平及p53激活情況顯著高于對照細胞;而CUL4B過表達細胞活性氧水平及p53激活情況均受到一定程度的抑制。我們由此推測CUL4B低表達強化了p53-ROS正反饋環(huán)，而CUL4B過

15、表達抑制了這一反饋環(huán)。我們進一步證實CUL4B對細胞早衰的調(diào)控依賴于p53-ROS正反饋環(huán)?；钚匝跚宄齽㎞-乙酰基半胱氨酸(NAC)的拯救實驗結(jié)果表明CUL4B缺失促進的早衰以及p53的過度激活依賴于細胞內(nèi)過量產(chǎn)生的ROS。而同時干擾CUL4B和p53后CUL4B低表達引起的過度早衰被完全逆轉(zhuǎn)，這一拯救實驗也進一步表明CUL4B缺失對細胞早衰的促進依賴于p53。綜上所述，CUL4B缺失后持續(xù)激活的p53-ROS正反饋環(huán)促進了細胞早衰，而

16、CUL4B過表達則通過抑制p53-ROS正反饋環(huán)減緩壓力誘導(dǎo)的細胞早衰。
　　第四部分 CUL4B促進p53的泛素化及蛋白降解
　　CUL4A與CUL4B存在大量的同源序列，因此在細胞功能上經(jīng)常發(fā)揮類似作用。已有文獻報導(dǎo)CUL4A可促進p53的泛素化降解，所以接下來我們檢測了CUL4B對p53泛素化的影響。我們發(fā)現(xiàn)壓力刺激后CUL4B能促進p53泛素化并促進p53的蛋白降解。氧化壓力刺激后，CUL4B缺失引起p53半衰期的延