CUL4B在神經膠質細胞瘤中的作用研究.pdf

1、膠質細胞瘤是最常見的中樞神經系統的原發(fā)性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率均較高，其起源于成熟的神經膠質細胞或神經干細胞，呈“樹根樣”廣泛的浸潤到周圍組織，導致手術難以徹底的切除，而且有極高的復發(fā)率。病人的存活率取決于腫瘤的類型及腫瘤的惡性程度，根據WHO的標準，膠質瘤的惡性程度分為四個等級(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ)。其中，Ⅳ型膠質母細胞瘤(GBM)的致死率最高，5年存活率低于10％，其原因在于手術全切除的難度極大，瘤細胞對放化療均不敏感。因此，在現代神經

2、外科學界針對膠質瘤的治療策略還存在巨大的挑戰(zhàn)。早在20世紀，科學家就提出膠質瘤是一種分子方面存在缺陷的遺傳病，并且推測可以通過分子治療手段來克服這一難題。目前關于膠質瘤的分子靶向治療已經引起人們的關注。 Cullin4B(CUL4B)是Cullin4B-Ring E3 ligase complex(CRL4B)的組成成分之一。Cullin4B以CRL4B的形式參與到蛋白質的泛素化進程當中，CRL4B在泛素-蛋白酶途徑中特異性識別底物，泛

3、素化過程在真核生物體內是信使RNA被轉譯成蛋白后的重要修飾之一，在體內，蛋白在酶的催化下被泛素化，然后進入蛋白酶體進行降解。泛素化進程在蛋白質合成與分解的動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用，參與到機體的細胞周期，生長發(fā)育和生殖等生理活動中。并且大量的研究報道提示CUL4B在DNA甲基化、蛋白分解以及腫瘤發(fā)生機制中起著重要的作用。而且相關研究提示我們Cullin4B在腦部的發(fā)育中承擔著重要角色。但有關CUL4B在人體腦部腫瘤中作用的相關研究較少，

4、包括膠質瘤。所以我們將CUL4B在膠質瘤中的角色及其相關作用分子進行了初步探討，希望能發(fā)現治療膠質瘤的一個新靶點，為膠質瘤靶向治療的提供一項新策略。
　　本研究首先表征了CUL4B在膠質瘤病變部分以及癌旁周圍腦組織中的表水平情況，然后通過體外實驗培養(yǎng)膠質瘤細胞U87和U251細胞株，并用RNA干擾技術(RNAi)成功建立CUL4B的內源性表達降低的膠質瘤母細胞模型，用western blot技術檢測慢病毒是否成功轉染膠質瘤細胞U8

5、7和U251，致CUL4B表達水平降低。除此之外，通過CCK-8細胞增殖實驗和結晶紫染色的方法完成了關于CUL4B對細胞生長和細胞集落形成的研究;用流式細胞技術監(jiān)測到CUL4B對U87、U251細胞周期產生的變化;用Transwell檢測方法觀察到CUL4B對U87、U251細胞的細胞遷移運動也起到一定作用;在體內試驗中，通過接種shRNA感染的U87、U251膠質瘤細胞，模擬CUL4B對體內腫瘤形成的影響，在功能上探究了CUL4B在膠

6、質瘤中的作用.本文同時也研究了下調CUL4B表達對細胞周期和細胞遷移的調控因子的影響。
　　實驗一CUL4B在膠質瘤組織與周圍腦組織中的表達情況
　　1.1 CUL4B在膠質瘤中及周圍腦組織中的表達
　　首先，實驗用qPCR的方法測定了15組膠質瘤及周圍腦組織中CUL4B的表達，與同組周圍正常的腦組織相比，14組的膠質瘤病變組織中CUL4B mRNA的表達升高了了3倍以上。該結果表明CUL4B在膠質瘤組織中高表達，可能

7、與腫瘤的發(fā)展有關。
　　實驗二CUL4B在膠質瘤中的作用研究
　　2.1通過慢病毒介導的shRNA降低膠質瘤細胞中的CUL4B表達
　　U87和U251細胞分別感染表達shRNA的慢病毒(Lv-shCon和Lv-shCUL4B)，4天后通過熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白的表達水平變化。Lv-shCon組和Lv-shCUL4B組中，80％的細胞表達GFP，表明細胞株中慢病毒感染成功。qPCR和western blotting

8、結果顯示Lv-shCUL4B中內源性CUL4B表達受到抑制。與未感染對照組相比，Lv-shCUL4B組U87細胞的CUL4B mRNA水平顯著下降，約77.4％，U251細胞中下降了77.8％，而在Lv-shCon和Con組間在CUL4B mRNA表達水平上沒有出現差別，有統計學意義。免疫印跡實驗亦證實兩種細胞株中CUL4B mRNA的下調同樣表現在蛋白水平上。因此，慢病毒包裝的shRNA可顯著降低神經膠質母細胞瘤中內源性CUL4B的表

9、達。
　　2.2下調CUL4B表達對膠質瘤細胞生長和集落形成的影響
　　慢病毒感染U87和U251細胞，通過CCK-8的檢測評價CUL4B對膠質瘤細胞生長的影響。結果顯示:第5天，與對照組相比，Lv-shCUL4B細胞生長明顯受到抑制，U87細胞降低了63.7％，U251細胞降低了45.5％，上述結果提示降低CUL4B的表達可顯著抑制兩種細胞U87、U251的生長過程。
　　慢病毒感染后，U87、U251細胞可見集落形

10、成（結晶紫染色），U87細胞，對照組和Lv-shCon組細胞集落數量均值高達150，而在Lv-shCUL4B組集落均數不到30。與此同時，U251細胞，對照組和Lv-shCon組細胞集落均數為200，而Lv-shCUL4B組集落均數不到40。這些結果均顯示下調CUL4B的表達可顯著降低神經膠質母細胞瘤(U87、U251)細胞集落的形成過程。
　　2.3下調CUL4B表達對膠質瘤細胞周期的影響
　　通過流式細胞技術得到的結果觀

11、察U87、U251兩種細胞的細胞周期排布，初步探索CUL4B調控細胞增殖的機制，發(fā)現處于細胞周期G1期的U87細胞，Con對照組約為50.0％，Lv-shCon對照組約為52.0％，而在Lv-shCUL4B組升高至約82.0％。相反，與Lv-shCon組相比， Lv-shCUL4B組處于S期的U87細胞明顯減少，Con對照組、Lv-shCon對照組和Lv-shCUL4B組分別為40.0％、38.0％、10％。與之類似，由于下調CUL4B

12、的表達，處于G1期的U251細胞比例上升，處于S期的比例下降。結果顯示下調CUL4B的表達可通過誘導細胞在G1期停滯從而抑制膠質瘤細胞的生長。
　　2.4下調CUL4B表達對膠質瘤細胞遷移的影響
　　Tmnswell檢測試驗發(fā)現U87、U251兩種膠質瘤細胞可以發(fā)生遷移運動，Lv-shCUL4B組U87細胞發(fā)生遷移的細胞平均數為65，遠遠少于空白組和Lv-shCon的平均數值，分別為224、210(p＜0.01)。下調CUL

13、4B的表達后，U251細胞發(fā)生遷移的數量亦明顯減少(p＜0.01)，結果顯示，通過下調CUL4B的表達可阻礙神經膠質母細胞瘤細胞的遷移。
　　2.5下調CUL4B表達對膠質瘤細胞皮下腫瘤形成的影響
　　通過接種慢病毒感染的U87、U251細胞，裸鼠種植異體人神經膠質母細胞瘤細胞模擬膠質瘤的模型成功，隨著種植細胞瘤的時間發(fā)展，各組皮下腫瘤形狀慢慢增大，然而與Lv-shCon組對比，Lv-shCUL4B組腫瘤增長速率明顯降低。與

14、Lv-shCon組相比，Lv-shCUL4B組U87細胞種植裸鼠腫瘤重量降低57.7％，U251細胞種植裸鼠腫瘤重量下降75.4％(p＜0.01)，上述體內和體外實驗結果進一步顯示，下調CUL4B的表達可有效的抑制膠質瘤的生長。
　　2.6下調CUL4B表達對膠質瘤細胞周期和細胞遷移的調控因子的影響
　　Western blot結果顯示，與空白對照組和Lv-shCon組相比，Lv-shCUL4B組Cyclin D1和MMP-

15、9表達水平下降，p16(INK4A)和PTEN表達水平升高。結果顯示，CUL4B可能是通過調節(jié)上述調控蛋白表達量的方式對膠質瘤細胞的生長和代謝起到重要作用。
　　本研究通過實時定量PCR技術檢測了膠質母細胞瘤組織中CUL4B呈現高表達狀態(tài)，研究顯示CUL4B參與膠質細胞瘤的發(fā)生發(fā)展。用慢病毒轉染技術成功建立CULB4的內源性表達降低細胞模型，探究CUL4B與膠質瘤細胞增殖，集落形成，細胞周期及皮下腫瘤形成的關系，研究顯示CUL4B

16、參與神經膠質細胞瘤的增殖，形成及細胞周期等過程中。結果顯示通過表達shRNA的慢病毒下調CUL4B的表達，可顯著抑制細胞增生及細胞集落的形成，上述兩種細胞系中Cyclin D1表達下調， p16表達上調從而使腫瘤細胞停滯在G1期，與此同時，腫瘤抑制因子PTEN的表達增加。進一步通過膠質瘤種植裸鼠模型發(fā)現，CUL4B的丟失可減輕體內腫瘤的形成，而且下調CUL4B的表達可抑制MMP-9的表達，從而阻止腫瘤細胞發(fā)生轉移。因此下調CUL4B的表