BDNF基因真核表達載體的構建及BDNF-GFP融合蛋白對神經(jīng)干細胞增殖、分化影響的研究.pdf

1、目的: 通過構建SD大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因的真核表達載體pEGFP-N1-BDNF，并將其轉(zhuǎn)染到胎鼠神經(jīng)干細胞(NSCs)中，觀察轉(zhuǎn)染的NSCs中BDNF-GFP融合蛋白的表達、以及融合蛋白對NSCs細胞的增殖和分化的影響，為下一步進行NSCs移植治療腦損傷及退行性腦疾病提供實驗準備。 方法: 通過設計BDNF的特異性引物，用RT-PCR的方法從SD大鼠海馬組織中獲取BDNF基因序列片段，將其克隆入真核細胞表達載

2、體pEGFP-N1中，通過PCR、雙酶切鑒定后，選出陽性克隆進行DNA測序鑒定。將構建成功的pEGFP-N1-BDNF重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染COS-7細胞和NSCs細胞。以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1和未轉(zhuǎn)染的細胞作為對照。用RT-PCR檢測BDNFmRNA表達情況；用免疫印跡、ELLAS法檢測BDNF-GFP融合蛋白表達情況；用MTT比色法和免疫細胞化學方法研究BDNF-GFP融合蛋白對NSCs細胞增殖和分化的影響。 結

3、果: 1.重組質(zhì)粒通過質(zhì)粒PCR、雙酶切后電泳顯示存在與BDNF目的基因大小相同的條帶，DNA測序結果顯示與Genebank公布的BDNF基因序列比較只有一個突變位點，但不影響正常BDNF蛋白的表達。 2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞后，RT-PCR鑒定顯示只有轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BDNF的COS-7細胞有BDNF mRNA表達：免疫印跡檢測顯示，僅轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BDNF的COS-7細胞有BDNF-GFP融合蛋白

4、表達，在48h以未成熟BDNF-GFP融合蛋白表達為主，在96h以成熟BDNF-GFP融合蛋白表達為主。 3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSCs細胞后，RT-PCR鑒定顯示只有轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BDNF的NSCs細胞有BDNF mRNA表達；ELLAS檢測顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BDNF的NSCs細胞在72-96h分泌的BDNF-GFP融合蛋白的量達高峰；MTT結果提示BDNF-GFP融合蛋白有抑制神經(jīng)干細胞增殖的作用；免疫細胞化學檢