雷公藤內(nèi)酯醇誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并增強(qiáng)硼替佐米的促骨髓瘤細(xì)胞凋亡活性.pdf

1、研究背景和目的:雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide)是從中藥雷公藤中萃取的有效活性成分,具有免疫抑制、抗炎和抗腫瘤作用,而現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)許多血液系統(tǒng)腫瘤有抗腫瘤作用。雷公藤內(nèi)酯醇可誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡,但目前對(duì)其作用機(jī)制仍不十分清楚。多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是種漿細(xì)胞的惡性腫瘤,分泌大量的免疫球蛋白,其高蛋白合成與分泌活性極易導(dǎo)致未/錯(cuò)折迭蛋白積聚于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔,誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic

2、 reticulum stress,ERS)。為了減輕ERS,骨髓瘤細(xì)胞活化了UPR信號(hào)通路,將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的蛋白折迭信息傳遞給細(xì)胞核,并引發(fā)細(xì)胞的一系列適應(yīng)性反應(yīng)來(lái)重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。UPR具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制,能通過IRE1α與PERK/eIFα信號(hào)通路而調(diào)控分子伴侶BiP表達(dá)及轉(zhuǎn)錄因子XBP-1、CHOP的活化,其中BiP與XBP-1促進(jìn)細(xì)胞生存,而CHOP則介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib)作為一種強(qiáng)而有效的2

3、6S蛋白酶體抑制劑(proteasome inhibitor,PI)可以選擇性的誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡,在治療復(fù)發(fā)難治性MM上取得了顯著的療效。硼替佐米引起ERS但是卻干擾未折迭蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡。考慮到UPR在多種分泌性腫瘤尤其是MM中有著重要的作用,本課題以MM細(xì)胞系NCI-H929、RPMI8226及MM原代細(xì)胞為研究材料,探尋雷公藤內(nèi)酯醇誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制以及

4、雷公藤內(nèi)酯醇聯(lián)合蛋白酶體抑制劑硼替佐米對(duì)促M(fèi)M細(xì)胞凋亡的活性影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法和結(jié)果:1.MTT法首先探尋雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide)對(duì)NCI-H929(H929)、RPMI8226(8226/S)及MM原代細(xì)胞的影響,以明確其劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系;結(jié)果表明雷公藤內(nèi)酯醇能夠夠抑制H929、8226/S及原代細(xì)胞的增殖,并呈濃度和時(shí)間依賴性。2. MTT法證實(shí)雷公藤內(nèi)酯醇的非抑制濃度(5-10ng/mL)聯(lián)合

5、蛋白酶體抑制劑硼替佐米對(duì)兩種細(xì)胞系和原代細(xì)胞均可產(chǎn)生增敏作用,與硼替佐米單藥相比差異顯著(P＜0.05)。3.透射電鏡證實(shí):雷公藤內(nèi)酯醇誘導(dǎo)H929細(xì)胞凋亡的情況;4.Western blot證實(shí):①雷公藤內(nèi)酯醇處理H929及8226/S細(xì)胞后0,8、12、24、36h,靶細(xì)胞中UPR相關(guān)蛋白XBP-1s、XBP-1u、Bip及CHOP的表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增加;②不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇處理NCI-H929及8226/S細(xì)胞后,靶細(xì)胞中UP

6、R相關(guān)蛋白XBP-1s、XBP-1u、Bip及CHOP的表達(dá)均呈劑量依賴性增加;③經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激劑Tg和BFA處理H929及8226/S不同時(shí)間后,細(xì)胞凋亡率和上述UPR相關(guān)蛋白表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增加,其與雷公藤內(nèi)酯醇處理后的變化趨勢(shì)基本一致,進(jìn)一步證明了雷公藤內(nèi)酯醇誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡與UPR有關(guān)。5. siRNA技術(shù)證明:通過慢病毒載體介導(dǎo)XBP-1 shRNA表達(dá),有效抑制H929和8226/S細(xì)胞XBP-1表達(dá)并增強(qiáng)其凋亡率,亦

7、能增加MM細(xì)胞對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇誘導(dǎo)凋亡的敏感性。
　　結(jié)論:1.雷公藤內(nèi)酯醇能夠呈時(shí)間、劑量依賴性誘導(dǎo)MM凋亡;2.雷公藤內(nèi)酯醇的非抑制濃度聯(lián)合硼替佐米,可增加骨髓瘤細(xì)胞對(duì)硼替佐米的敏感性;3、雷公藤內(nèi)酯醇誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,但是卻干擾了未折迭蛋白反應(yīng),致使其保護(hù)成分XBP-1和Bip與促凋亡成分CHOP表達(dá)失衡,導(dǎo)致靶細(xì)胞的凋亡4、沉默UPR的關(guān)鍵成分XBP-1基因可誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡,亦增強(qiáng)雷公藤內(nèi)酯醇促M(fèi)M細(xì)胞凋亡活性,證