丹參酮ⅡA對(duì)心室重塑的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：近來(lái)研究表明從高血壓疾病導(dǎo)致的左心室肥厚到充血性心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的基本機(jī)制是心室重塑，心肌細(xì)胞的凋亡、肥大均為心室重塑的特征性改變。心室重塑是由于一系列復(fù)雜的分子和細(xì)胞機(jī)制導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)、功能和表型的變化，這些變化包括心肌細(xì)胞肥大、凋亡、胚胎基因和蛋白的表達(dá)，以及心肌外基質(zhì)和組分的變化等。抑制與心室重塑有關(guān)的刺激、介導(dǎo)因素，從而改善心功能，是目前治療心力衰竭的重點(diǎn)方向。近來(lái)的研究表明，在壓力負(fù)荷等病理因素所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞肥大

2、反應(yīng)中，血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是重要的刺激因子；AngII既可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，也可引起心肌細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞肥大是指心肌細(xì)胞體積增大和肌節(jié)數(shù)量增多，并出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)收縮蛋白類(lèi)型改變，心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量和3H-Leu摻入率的測(cè)量可反映心肌細(xì)胞肥大的程度。許多刺激因子如機(jī)械牽張、AngⅡ、內(nèi)皮素(Endothelin-1，ET-1)均可引起心肌肥厚。AngⅡ作為重要的神經(jīng)體液因子，不僅對(duì)心血管系統(tǒng)有重要的生理調(diào)節(jié)作

3、用，在心肌肥厚、心力衰竭等病理生理過(guò)程也具有重要的作用。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞有絲分裂功能相反，是一個(gè)自由基調(diào)控的主動(dòng)有序的細(xì)胞自我消亡過(guò)程。心肌細(xì)胞增生能力有限而且數(shù)目相對(duì)固定，心肌細(xì)胞凋亡是心肌收縮單元的減少，進(jìn)而導(dǎo)致心臟泵血功能減退的重要原因，在心臟疾病的發(fā)展中起重要作用。最近研究認(rèn)為體液因子和細(xì)胞因子是心肌細(xì)胞凋亡重要決定因素;血管緊張素II介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。
　　 丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA,STS)是“活血化瘀”中

4、藥丹參的脂溶性有效單體，具有抗缺血缺氧，改善微循環(huán)，抑制血小板粘附聚集功能和抗血栓形成作用，臨床上主要用于冠心病的治療,但其對(duì)心肌肥厚以及心肌細(xì)胞凋亡的作用報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞研究丹參的主要成份丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA,STS)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大及心肌細(xì)胞凋亡的影響，探討STS此作用的可能機(jī)制，為其在臨床用于心肌重塑的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：①在原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞上，用血

5、管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，丹參酮ⅡA和纈沙坦(Valsartan)進(jìn)行干預(yù)；采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性；采用相差顯微鏡測(cè)量細(xì)胞大小，3H-亮氨酸摻入法測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率作為心肌細(xì)胞肥大的指標(biāo)；②在原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞上，觀察丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡ,STS)對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡA，AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響。實(shí)驗(yàn)用新生大鼠，差數(shù)貼壁法體外分離培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞。用血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞

6、肥大，丹參酮ⅡA和纈沙坦(Valsartan)進(jìn)行干預(yù)；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)心肌細(xì)胞原癌基因c-fos、c-jun、c-myc mRNA的表達(dá)；③在原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞上，觀察丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡ,STS)對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡA，AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響。實(shí)驗(yàn)用新生大鼠，差數(shù)貼壁法體外分離培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞。用血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，丹參酮ⅡA和纈沙坦(Vals

7、artan)進(jìn)行干預(yù)；檢測(cè)CaN活性、免疫熒光標(biāo)記法或Western-blot檢測(cè)CaN、NFAT3蛋白表達(dá)情況；④在原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞上，觀察丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡ,STS)對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡA，AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)用新生大鼠，差數(shù)貼壁法體外分離培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率的變化；⑤在原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞上，觀察丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡ,S

8、TS)對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡA，AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)用新生大鼠，差數(shù)貼壁法體外分離培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞。用血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，丹參酮ⅡA和纈沙坦(Valsartan)進(jìn)行干預(yù)；Western-blot檢測(cè) bcl-2/bax蛋白表達(dá)情況；⑥在原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞上，觀察丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡ,STS)對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡA，AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影

9、響。實(shí)驗(yàn)用新生大鼠，差數(shù)貼壁法體外分離培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞。用血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，丹參酮ⅡA和纈沙坦(Valsartan)進(jìn)行干預(yù)；Western-blot和RT-PCR檢測(cè)Fas/FasL表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：① STS對(duì)心肌細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用；AngⅡ持續(xù)作用7d后，心肌細(xì)胞直徑明顯增大(P<0.01)，STS對(duì)AngⅡ刺激引起的細(xì)胞肥大有抑制作用，且其抑制性作用呈劑量依賴(lài)性；AngII作用24h后，心肌細(xì)胞蛋白合成

10、速率AngII組較對(duì)照組明顯增加(P<0.01)；STS對(duì)AngⅡ刺激引起的心肌細(xì)胞蛋白合成速率有抑制性作用，且其抑制性作用呈劑量依賴(lài)性。②在培養(yǎng)液中加入AngⅡ作用30min后，c-fos、c-jun、c-myc mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)，預(yù)先加入STS作用30min，可抑制AngⅡ的作用，且其抑制性作用呈劑量依賴(lài)性。③ AngⅡ作用12h后，心肌細(xì)胞CaN活性增高，CaN和p-CaN蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)；NFAT3蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，且出現(xiàn)

11、核轉(zhuǎn)移。STS可以抑制血管緊張素Ⅱ剌激心肌細(xì)胞CaN活性的增高，CaN、p-CaN、 NFAT3蛋白表達(dá)的增加、抑制NFAT3的核轉(zhuǎn)移；其抑制性作用呈劑量依賴(lài)性。④AngⅡ作用48h后，心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，STS能顯著降低AngⅡ引起的心肌細(xì)胞凋亡率的升高(P<0.01)。⑤AngⅡ作用12h后，AngⅡ剌激組心肌細(xì)胞bcl-2/bax明顯低于對(duì)照組(P<0.01)；丹參酮ⅡA可以抑制血管緊張素Ⅱ剌激心肌細(xì)胞bcl-

12、2/bax的降低，其抑制性作用呈濃度依賴(lài)性。⑥AngⅡ作用12h后，AngⅡ剌激組心肌細(xì)胞Fas和FasL mRNA及其蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；丹參酮ⅡA可以抑制血管緊張素Ⅱ剌激心肌細(xì)胞Fas和FasL mRNA及其蛋白表達(dá)的升高，其抑制性作用呈濃度依賴(lài)性。
　　 結(jié)論：①STS具有抑制Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用。②STS能夠抑制Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，可能與其能抑制血管緊張素Ⅱ剌激心肌細(xì)胞Ca

13、N活性的升高及NFAT3核轉(zhuǎn)移有關(guān)。③STS能夠抑制Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，可能與其能抑制血管緊張素Ⅱ剌激心肌細(xì)胞原癌基因c-fos、c-jun、c-myc表達(dá)的升高有關(guān)。④STS能夠抑制Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。⑤STS能夠抑制Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，可能與其能抑制血管緊張素Ⅱ剌激心肌細(xì)胞bcl-2/bax的降低有關(guān)。⑥STS能夠抑制Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，可能與其能抑制血管緊張素Ⅱ剌激心肌細(xì)胞Fas和F