內(nèi)皮素-1及內(nèi)皮素A受體拮抗劑對大鼠腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響.pdf

1、背景與目的：腎間質(zhì)纖維化(Renal Intersititial Fibrosis,RIF)是大多數(shù)腎病進展為終末期腎衰竭共同的途徑和主要病理學基礎。腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化,并生成腎間質(zhì)肌成纖維細胞(MyoF)是腎間質(zhì)纖維化的重要機制之一,MyoF可分泌大量的Ⅰ型膠原纖維(collagenⅠ,ColⅠ)、纖連蛋白等細胞外基質(zhì)(Extra-cellularmatrix ECM)成分,進而導致ECM過度積聚,在腎間質(zhì)纖維化中起到

2、了至關重要的作用。腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal transition EMT)指腎小管上皮細胞失去其上皮細胞表型,獲得間充質(zhì)細胞特性的過程,是MyoF的主要來源,主要相關蛋白有波形蛋白(Vimelltin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-Smoothmuscle actin,α-SMA)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白(zonulaoccludens-1,ZO-1)及ColⅠ等,α-S

3、MA是具有收縮功能的細胞骨架微絲結構,在轉(zhuǎn)分化過程中表達增多,是腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化形成MyoF的標志蛋白,不但標志上皮細胞產(chǎn)生形態(tài)學變化,而且也使MyoF具備遷移、浸潤和收縮功能。Vimentin表達于間充質(zhì)細胞,是一種參與形成細胞骨架的中間絲蛋白,在轉(zhuǎn)分化過程中表達亦增多。E-cadherin是一種腎小管上皮細胞間的粘附分子,是反映上皮細胞特征的重要標志,在轉(zhuǎn)分化過程中表達被抑制。EMT在發(fā)生的早期撤除損傷刺激,EMT具有一定的可逆

4、性,當損傷刺激持續(xù)一定時間后,EMT才變得不可逆,所以,損傷刺激的作用時間是EMT發(fā)生的一個重要因素。
　　 內(nèi)皮素-1(Endothelin-1,ET-1)是目前已知內(nèi)源性的最強和效應最持久的內(nèi)源性血管收縮劑。在腎臟中,血管內(nèi)皮細胞、足細胞、系膜細胞及腎小管上皮細胞均可分泌ET-1,并通過與2種不同內(nèi)皮素受體(ETA受體和ETB受體)結合,影響細胞微環(huán)境,發(fā)揮不同的生理作用。生理狀態(tài)下ET-1參與調(diào)節(jié)腎小球過濾率、腎臟血流量、

5、腎小管重吸收及腎細胞生物學功能等多種重要功能的調(diào)節(jié)。多種因素如:醛固酮、血管緊張素Ⅱ、缺氧、活性氧等均可促進ET-1的產(chǎn)生。大量的研究顯示,在不同原因引起的CKD中,ET-1可通過與ETA受體結合,介導RIF,細胞增生和炎性細胞浸潤。ET-1介導腎臟損傷的途徑除了其具有強大的腎臟血管的收縮作用、促進系膜細胞收縮及趨化單核細胞外,還參與促進了RIF。目前的研究表明ET-1參與RIF的途徑可能有:(1)與RAS系統(tǒng)的相互作用,促進醛固酮增多

6、;(2)促進腎間質(zhì)成纖維細胞增殖:(3)調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs,導致細胞外基質(zhì)積聚。而在人體其他組織中如:卵巢癌的發(fā)生、肺纖維化過程,ET-1還具有介導上皮細胞轉(zhuǎn)分化的功能。最近發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠模型中,可檢測到腎小管上皮細胞中,內(nèi)皮素-1與α-平滑肌肌動蛋白的表達增多,E-鈣粘蛋白的表達降低,且冬蟲夏草可抑制上述過程,提示ET-1可誘導腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化,參與RIF過程。目前,關于內(nèi)皮素受體拮抗劑的研究已廣泛開展,內(nèi)皮素受體拮抗劑中

7、目前研究的最多的是選擇性A受體拮抗劑和非選擇性受體拮抗劑,現(xiàn)有的研究資料表明,這2種拮抗劑中,選擇性A受體拮抗劑具有更好的抗高血壓和降尿蛋白的作用,并且比非選擇性受體拮抗劑的副作用更少。本實驗中BQ123時即屬于內(nèi)皮素A受體拮抗劑。
　　 ET-1作為重要的促纖維化因子,EMT作為RIF的重要途徑之一,二者之間的關系尚未完全明確。為進一步明確ET-1與EMT之間的關系,本文通過觀察內(nèi)皮素-1(ET-1)及內(nèi)皮素A受體拮抗劑(ET

8、aRA)對大鼠腎小管上皮細胞(NRK53E)轉(zhuǎn)分化(EMT)的影響,探討ET-1參與腎間質(zhì)纖維化的作用機制。
　　 方法:應用ET-1刺激體外培養(yǎng)的NRK52E或經(jīng)ETaRA預處的NRK-52E細胞,應用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)分化相關蛋白α-SMA、vimentin及E-cadherin mRNA的表達;應用western印跡檢測α-SMA、vimentin及E-cadherin蛋白的表達。
　　 結果:
　　 1.

9、ET-1(10-11-10-7mol/L,60h)可以上調(diào)NRK52細胞α-SMA、vimentin及下調(diào)E-cadherin的表達,10-7mol/L作用最明顯,呈濃度依賴(P＜0.05)。
　　 2.應用10-7mol/L ET-1刺激NRK52E時,α-SMA、vimentin在36h時開始增多,于60h時達到高峰;E-cadherin在36h時開始減少,于60h時達到最低。Α-SMA、vimentin mRNA于36h時

10、開始升高,60h時達到高峰;E-cadherin mRNA于36h時開始減少,60h時達到最低(P＜0.05)。
　　 3.ETaRA可特異性阻斷上述作用。
　　 結論:
　　 1.ET-1可上調(diào)α-SMA、vimentin及下調(diào)E-cadherin的表達,刺激NRK52E轉(zhuǎn)分化,并可能經(jīng)由此途徑參與疾病狀態(tài)下的腎間質(zhì)纖維化過程。
　　 2.ET-1刺激NRK52E轉(zhuǎn)分化部分由內(nèi)皮素A受體介導。