內(nèi)皮素-1及其受體、受體拮抗劑在肺動(dòng)脈高壓綜合征肉雞中的作用研究.pdf

1、肉雞肺動(dòng)脈高壓綜合征(pulmonaryhypertensionsyndrome，PHS)亦稱肉雞腹水綜合征(ascitessyndrome，AS)，又稱“心衰綜合征”(heartfailuresyndrome，HFS)等，是快速生長(zhǎng)肉雞的一種常見非傳染性疾病，以明顯的腹水和心、肺功能衰竭為特征。全世界養(yǎng)雞業(yè)每年因此病而損失巨大，隨著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，該病的發(fā)生有逐漸上升之勢(shì)。肺動(dòng)脈壓升高是肉雞肺動(dòng)脈高壓綜合征的重要特點(diǎn)并對(duì)它的形成起決定性

2、作用。內(nèi)皮素(endothelin-1，ET-1)是一種由內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌的、具有強(qiáng)烈收縮血管作用和促進(jìn)細(xì)胞增生的血管活性多肽，心鈉素(atrialnatriureticpeptide，ANP)、血管緊張素H(angiotensinⅡ，AH)、NO等在心血管系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)中也起著重要作用。為研究肉雞PHS的發(fā)病機(jī)理，本試驗(yàn)主要從ET-1角度出發(fā)，從以下幾個(gè)方面對(duì)本試驗(yàn)進(jìn)行了研究：用高能日糧飼喂較多肉雞的方法獲得PHS肉雞模型；用放射免

3、疫分析方法比較了不同腹水程度肉雞在不同日齡時(shí)血漿和主要組織中ET-1的含量，同時(shí)還用硝酸還原酶法和放射免疫法對(duì)NO、NOS、ANP、AⅡ在肉雞PHS發(fā)病過程中的作用加以研究；通過免疫組織化學(xué)染色方法和RT-PCR的方法研究了ETA受體及其基因在不同腹水程度和不同日齡肉雞體內(nèi)的分布情況及其表達(dá)水平；通過短期靜脈注射ET-1、內(nèi)皮素受體拮抗劑BQ123和長(zhǎng)期給予ET-1的方法研究了ET-1、BQ123對(duì)肉雞肺動(dòng)脈壓、PHS發(fā)病率、主要組織病

4、理變化以及一些生理生化指標(biāo)的影響；同時(shí)利用細(xì)胞培養(yǎng)的方法研究了ET-1、BQ123、L-Arg、L-NAME對(duì)培養(yǎng)的肉雞心肌細(xì)胞的作用，從而比較全面地從ET-1的角度研究了肉雞PHS的發(fā)病機(jī)理。主要試驗(yàn)結(jié)果如下： (1)用高能日糧飼養(yǎng)肉雞時(shí)從10日齡起有PHS發(fā)生，發(fā)病率為5.3％-6.7％，與自然情況下的發(fā)病率基本相同；右心導(dǎo)管法研究發(fā)現(xiàn)2-6周齡時(shí)肺動(dòng)脈高壓(PH)組肉雞的平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)極顯著(p＜0.01)高于正

5、常組肉雞；腹水心臟指數(shù)(ascitesheartindex，AHI)也極顯著(p＜0.01)或顯著(p＜0.05)高于正常組，且隨日齡的增長(zhǎng)有上升的趨勢(shì)；PH組肉雞血漿和主要組織(心、肝、肺、腎)中ET-1在2-5周齡時(shí)也顯著(p＜0.01)或極顯著(p＜0.05)高于正常組，而在6周齡時(shí)則呈現(xiàn)出復(fù)雜的變化；血漿ANP、NO、AⅡ在2-5周齡時(shí)顯著或極顯著高于正常組，隨日齡的增長(zhǎng)有升高的趨勢(shì)，而在6周齡時(shí)則呈現(xiàn)出不規(guī)則的變化；幾種組織相

6、比，肺臟ET-1的含量最高；mPAP與血漿ET-1相關(guān)性顯著，與血漿NO沒有相關(guān)性，血漿ET-1與NO也沒有明顯的相關(guān)性。 (2)用免疫組織化學(xué)染色的方法和RT-PCR的方法對(duì)不同腹水程度、不同日齡肉雞ETAR及其基因在體內(nèi)定位及其表達(dá)變化的情況進(jìn)行了探討。免疫組織化學(xué)染色的研究結(jié)果表明，ETAR在肉雞主要組織如心臟中的心肌細(xì)胞膜、心包膜和血管平滑肌，肝臟中的肝細(xì)胞膜和枯否氏細(xì)胞，肺臟中的大小血管、次級(jí)支氣管、三級(jí)支氣管和肺泡，

7、腎臟的近遠(yuǎn)曲小管、腎小球、致密斑、髓袢、腎血管均有不同程度的表達(dá)；與正常組相比較，PH組、輕度腹水組、重度腹水組肉雞肺臟各級(jí)血管以及肺泡ETAR的表達(dá)均比正常組顯著或極顯著升高，但隨著腹水程度的加深，ETAR的表達(dá)量反而降低，其中PH組ETAR的表達(dá)量最高；隨腹水程度的加深，心臟ETAR的表達(dá)量顯著或極顯著降低，但仍顯著或極顯著高于正常組，右心室心肌中ETAR的表達(dá)量明顯高于左心室心肌；PH組和輕度腹水組肉雞肝細(xì)胞ETAR的表達(dá)量比正常

8、組和重度腹水組均高，而肝血管中腹水組同正常組相比較其表達(dá)量極顯著降低；腎小管、腎血管、腎小球和致密斑中ETAR的表達(dá)隨腹水程度的加深也呈現(xiàn)出復(fù)雜的變化；對(duì)于不同日齡的正常肉雞，內(nèi)皮素A型受體基因mRNA在心臟組織中的表達(dá)量在16日齡時(shí)明顯低于30日齡時(shí)的表達(dá)量，而對(duì)于同一日齡(30d)的肉雞，發(fā)生重度腹水的肉雞內(nèi)皮素A型受體基因mRNA的表達(dá)量明顯要低于正常肉雞。 (3)2-6周齡不同腹水程度(正常組、輕度腹水組、重度腹水組)肉

9、雞之間相比較，mPAP、AHI以及血漿ET-1、ANP、NO均隨腹水程度的加深而顯著(p＜0.05)或極顯著(p＜0.01)升高，且隨日齡的增長(zhǎng)而呈升高趨勢(shì)，而全心/體重比(TV/Bw)隨日齡的增長(zhǎng)卻呈下降趨勢(shì)；不同腹水程度肉雞血漿iNOS和cNOS隨腹水程度的加深而呈現(xiàn)出復(fù)雜的變化；用放射免疫分析的方法對(duì)5周齡不同腹水程度的肉雞主要組織中ET-1、ANP的研究發(fā)現(xiàn)，5周齡時(shí)主要組織中的ET-1、ANP均隨腹水程度的加深其含量顯著(p＜

10、0.05)或極顯著(p＜0.01)增加，且肺臟和心臟的含量明顯高于其它組織中的含量；肺組織中iNOS、cNOS的含量呈現(xiàn)出比較復(fù)雜變化趨勢(shì)，iNOS隨腹水程度的加深和日齡的增長(zhǎng)而呈升高趨勢(shì)，而cNOS則隨腹水程度的加深呈降低趨勢(shì)；不同腹水程度肉雞之間AHI與mPAP以及血漿ANP、ET-1與AHI、mPAP之間存在正相關(guān)性，5周齡時(shí)mPAP、AHI與心臟ET-1含量之間也存著正相關(guān)性，而血清NO含量與血漿ET-1、ANP、心臟ET-1含

11、量之間無明顯的相關(guān)性。 (4)對(duì)28日齡肉雞分組并從翼靜脈注射不同劑量的ET-1、BQ123以及ET-1和BQ123聯(lián)合應(yīng)用，并以注射生理鹽水組為對(duì)照組，對(duì)mPAP進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還檢測(cè)了不同時(shí)間血漿AⅡ、ANP、ET-1的變化。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)靜脈注射24、120、240ng/kg的ET-1后，高劑量的ET-1可引起血壓雙向性升高，即先瞬時(shí)下降然后呈劑量依賴性升高，內(nèi)皮素的有效升壓劑量為240ng/kg；靜脈注射0.5、1、3μg/

12、kg的BQ123能使mPAP呈劑量依賴性下降，且能完全拮抗1×10-8mol/L的ET-1引起的血壓升高效應(yīng)，但不能拮抗ET-1引起的初始血壓下降現(xiàn)象；另外在注射ET-1或BQ123后對(duì)不同時(shí)間血漿ET-1、ANP、AⅡ也有明顯的影響。從15日齡開始將170只肉雞分為3組，對(duì)照組50只注射生理鹽水，另兩組各60只分別注射240、360ng/kg的ET-1，發(fā)現(xiàn)ET-1呈劑量依賴性地提高了肉雞PHS的發(fā)病率，并且使試驗(yàn)組肉雞的紅細(xì)胞壓積(

13、PCV)、mPAP、AHI、血漿NO不同程度地升高，且隨日齡的增長(zhǎng)而呈現(xiàn)出增加趨勢(shì)；組織切片顯示當(dāng)長(zhǎng)期注射外源性的ET-1后肉雞主要組織如心、肝、肺、腎均發(fā)生了不同程度的病理學(xué)變化。 (5)用酶消化法對(duì)肉雞心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并用免疫化學(xué)染色方法對(duì)肉雞心肌細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，試驗(yàn)采用第3至5代的心肌細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。用MTT法以及3H-TdR、3H-Pro、3H-Leu滲入法研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ET-1的濃度≥1×10-8mol/L時(shí)，ET-1對(duì)

14、心肌細(xì)胞有明顯的促生長(zhǎng)和促肥大作用，ET-1濃度越高，則其促心肌細(xì)胞生長(zhǎng)作用越強(qiáng)，1×10-8mol/L的BQ123則可完全拮抗ET-1對(duì)心肌細(xì)胞的作用，且BQ123濃度越高，則抑制作用越明顯，而單獨(dú)加入不同濃度的BQ123也發(fā)現(xiàn)BQ123呈劑量依賴性抑制心肌細(xì)胞的增殖；用熒光標(biāo)記法研究發(fā)現(xiàn)，ET-1可呈劑量依賴性地促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i內(nèi)流，BQ123則可拮抗ET-1這種作用，但不能拮抗ET-1初期對(duì)心肌細(xì)胞[Ca2+]i瞬時(shí)增