人mda-7-IL-24及其剪接變異體mda-7-IL-24as1對惡性造血腫瘤細胞的促分化作用的研究.pdf

1、黑色素瘤分化相關基因-7(mda-7，又稱1L-24)是1995年采用減數雜交技術在誘導終末分化的人黑色素瘤細胞HO-1中發(fā)現的新基因。mda-7/IL-24在很多實體腫瘤(包括黑色素瘤、前列腺癌、宮頸癌、小細胞肺癌、惡性神經膠質細胞瘤等)中異位表達時具有腫瘤細胞特異性抑制生長和誘導凋亡作用：此外，還可以抑制腫瘤血管新生、具有抗腫瘤“旁觀者效應”以及能夠增強腫瘤細胞對射線的敏感性。研究發(fā)現mda-7/IL-24在實體瘤中的抗腫瘤作用機制

2、是多種多樣的，而對造血系統惡性腫瘤的作用還不清楚。我們在前期工作中，在誘導白血病細胞系【J937、HL60向單核一巨噬細胞分化后發(fā)現有mda-7/IL-24及mda-7/IL-24選擇性剪接體IL-24asl的表達。mda-7/IL-24及IL-24asl在HL-60、U937白血病中的作用，與白血病細胞分化的關系尚無文獻報道。 為了探索mda-7/IL-24、IL-24asl以及二者同時存在情況下對HL-60、U937的作用，

3、我們構建了mda-7/IL-24、剪接體IL-24asl、IL-24和IL-24asl共表達的真核表達載體plRES-IL-24、plRES-IL-24asl、plRES-IL-24-IL-24asl，通過電穿孔法瞬時轉染人白血病細胞系U937、HL60，經confocol和Western blot方法鑒定轉染效率及目的基因的表達情況。通過生長曲線、集落形成實驗、FACS和動物實驗來評價mda-7/IL-24、剪接體IL-24asl以及

4、IL-24-IL-24asl對腫瘤細胞增殖、集落形成能力、凋亡情況、體內致瘤性變化的影響來評價mda-7/IL-24、IL-24asl、IL-24-IL-24asl對HL-60、U937的抗腫瘤作用，并且通過形態(tài)學染色和細胞表面單核巨噬系分化標志分子CD11b、CD14、M-CSFR的檢測來評價其對單核巨噬系分化的影響。結果發(fā)現，與轉染空載體對照組相比，瞬時轉染48 h、72 h，HL-60、U937細胞均出現mda-7/LI-24、I

5、L-24asl、IL-24．IL-24asl蛋白表達，72 h達到高峰期。瞬時表達mda-7/IL-24、IL-24asl、IL-24-IL-24asl的細胞生長狀態(tài)、細胞增殖活力以及集落形成能力與對照組相比明顯下降(p<0.05)，凋亡率與對照比明顯升高(p<0.05)，其中IL-24asl抑制腫瘤細胞生長作用較強，而IL-24的促凋亡能力較強。裸鼠體內腫瘤形成實驗進一步證實了mda-7/IL-24、IL-24asl、IL-24-IL

6、-24asl的抗腫瘤作用。細胞分化相關實驗結果證實，與對照組相比，mda-7/IL-24、IL-24asl、IL-24-IL-24asI具有明顯促進U937、HL60向單核巨噬系分化能力(P<0.05)，CD11b、CD4、M-CSFR表達明顯升高，其中IL-24asl的促分化作用較強。上述結果表明，mda-7/IL-24、剪接體IL-24asl、IL-24-IL-24asl均有抑制腫瘤生長和促進腫瘤細胞分化成熟的作用，其中剪接體IL-

7、24asl的促分化作用較強，IL-24的促凋亡作用較強。盡管HL-60、U937在用誘導劑誘導分化后可以同時出現mda-7/IL-24及IL-24asl的表達，但將mda-7/IL-24及其剪接體IL-24asl同時異位轉染到白血病細胞，并不能使抑制生長、誘導凋亡、誘導分化作用較單獨基因轉染更強，可能二者之間不存在協同作用方式。 為了進一步證實mda-7/IL-24、剪接體IL-24asl、IL-24-IL-24asl對白血病細

8、胞的誘導分化作用，我們又通過電穿孔方法將特異性針對于mda-7/IL-24和IL-24asl基因的干擾片斷siRNA瞬時轉染到U937、HL60細胞系中，同時加入TPA誘導mda-7/IL-24和IL-24asl的表達。通過形態(tài)學染色和檢測細胞表面CD11b、CD14、M-CSFR的表達來評價siRNA對mda-7/IL-24和IL-24asl基因表達的干擾是否影響誘導劑對HL-60、U937的誘導分化作用。Western blot測定

9、干擾效率可達80％。形態(tài)學及分化相關分子表達均證實，siRNA干擾mda-7/IL-24以及IL-24asl的表達，會使誘導劑失去對U937、HL60細胞向單核巨噬系誘導分化作用。以上結果進一步表明mda-7/IL-24和IL-24asl與U937、HL60細胞的單核巨噬系分化密切相關。 為了進一步檢測mda-7/IL-24以及IL-24asl能否誘導單核細胞白血病病人骨髓幼稚細胞分化和凋亡，我們收集了3例M5型白血病病人骨髓單

10、個核細胞，通過電穿孔方法瞬時轉染plRES-IL-24、plRES-IL-24asl以及plRES-IL-24．IL-24asl，72 h后通過FACS檢測細胞表面CD11b、CD14、M-CSFR的表達、凋亡的變化以及進行細胞形態(tài)學染色。結果發(fā)現瞬時轉染plRES-IL-24、plRES-IL-24asl、plRES-IL-24-IL-24asl的細胞與轉染空載體的細胞相比，有明顯的促進病人細胞分化成熟的作用，CD11b、CD14、M

11、-CSFR指標各有不同程度的升高。形態(tài)學染色亦表明IL-24asl、 IL-24、IL-24-IL-24asl具有促病人BMMC向成熟階段分化的作用。凋亡檢測表明瞬時轉染plRES-IL-24、plRES-IL-24asl以及plRES-IL-24-IL-24asl對兩例病人有明顯的促凋亡作用。 我們的工作首次證明，異位表達的mda-7/IL-24、IL-24asl、IL-24．IL-24asl可抑制造血系統惡性腫瘤細胞HL-6