鹽脅迫紅麻葉片差異蛋白質(zhì)組學(xué)及其抗氧化酶活性的分析.pdf

1、紅麻(Kenaf)是錦葵科(Malvaceae)木槿屬(Hibiscus)一年生韌皮纖維作物,具有耐旱、耐鹽、耐貧瘠、生物產(chǎn)量高等特性。巨大的生物產(chǎn)量是樹(shù)木的3-4倍,極強(qiáng)的二氧化碳吸收能力為森林的4-5倍。我國(guó)沿海新墾鹽堿地和華北、西北、東北地區(qū)的內(nèi)陸次生鹽堿地大量未被開(kāi)墾,這些鹽堿地均可因地制宜種植紅麻,利用山地、鹽堿地、邊雜地種植紅麻成為低碳產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方向。
　　 本研究重點(diǎn)用蛋白組學(xué)方法鑒定紅麻抵御鹽脅迫的相關(guān)功能蛋

2、白,并初步了解其功能,擬探明紅麻抵御鹽害的蛋白質(zhì)水平上的機(jī)理。此外,也進(jìn)一步分析了鹽脅迫條件下紅麻抗氧化酶系統(tǒng)活性的變化趨勢(shì),以及它們之間相互協(xié)調(diào)作用的關(guān)系,這些都為進(jìn)一步研究紅麻耐鹽分子和生化機(jī)理和為鹽堿地利用及指導(dǎo)紅麻生產(chǎn)栽培提供理論基礎(chǔ)。
　　 本研究首先建立和優(yōu)化了紅麻雙向電泳體系。以福紅952新鮮葉片為材料,分別采用了TCA-丙酮法、尿素-硫脲法、酚抽提法提取葉片蛋白,在蛋白提取效率,單向和雙向電泳圖譜等方面比較了這三

3、種方法的提取效果,同時(shí)還從IPG干膠條pH范圍選擇、上樣方式、上樣量、分離膠濃度這幾個(gè)主要方面優(yōu)化了體系。結(jié)果表明:用酚抽提法提取的蛋白純度較高,單向和雙向電泳圖譜效果較好,獲得了26條蛋白質(zhì)條帶和1436個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。紅麻蛋白主要分布在pH4～7范圍內(nèi),采用主動(dòng)水化上樣,上樣量為1.4mg,12％的分離膠來(lái)分離可得到蛋白點(diǎn)清晰,分布均勻,背景清楚的凝膠圖譜。
　　 接著利用優(yōu)化后的蛋白組學(xué)雙向電泳體系來(lái)研究鹽脅迫下紅麻的差異蛋白

4、。將福紅952幼苗分別在0、70、140、200 mM NaCl的半強(qiáng)度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液下處理6 d后,用酚抽提法提取葉片蛋白,蛋白用雙向電泳分離(pH4-7膠條,12.5％gel)。實(shí)驗(yàn)最少進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù),用ImageMaster7.0軟件分析得知:平均每塊凝膠大約有1000個(gè)蛋白點(diǎn)成功匹配,在表達(dá)量大于2倍和Anova<0.05條件下可得到62個(gè)表達(dá)差異點(diǎn),經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜分析共鑒定出放氧增強(qiáng)蛋白、小熱休克蛋白、脫氫

5、抗壞血酸還原酶、硝酸還原酶、超氧化物歧化酶等42個(gè)差異蛋白,其中S-腺苷甲硫氨酸依賴甲基是經(jīng)脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的,36個(gè)蛋白在鹽脅迫下表達(dá)量有所上調(diào),6個(gè)蛋白下調(diào)。這些蛋白按主要功能可分為物質(zhì)代謝、蛋白合成與降解、細(xì)胞防御、細(xì)胞生長(zhǎng)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、光和作用等。果糖二磷酸醛縮酶表達(dá)量的下調(diào)影響了糖和淀粉的合成和積累,這可能導(dǎo)致紅麻生長(zhǎng)受抑制；0,5-二磷酸核酮糖羧化酶和與光和作用相關(guān)的蛋白上調(diào)加強(qiáng)了紅麻在逆境下的光呼吸來(lái)抵御鹽害；超氧化物歧化酶表達(dá)

6、量上調(diào),使紅麻清除細(xì)胞內(nèi)的自由基能力提高。差異蛋白參與代謝過(guò)程有些是一種普遍的脅迫反應(yīng),來(lái)幫助紅麻在逆境條件下生存,也有些代謝過(guò)程會(huì)有助于減少鹽脅迫產(chǎn)生的負(fù)面的生理影響。紅麻可以在鹽脅迫下,經(jīng)過(guò)多種途徑來(lái)調(diào)節(jié)鹽脅迫反應(yīng)蛋白,從而影響代謝模式、細(xì)胞功能、細(xì)胞防御以維持相對(duì)的離子平衡和生長(zhǎng)。
　　 最后,進(jìn)一步分析了不同鹽脅迫條件下紅麻葉片的抗氧化酶活性的變化。將紅麻幼苗在0、140 mM NaCl的半強(qiáng)度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液下分

7、別處理3、6、9 d和在0、70、140、200 mM NaCl的半強(qiáng)度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液下處理6 d,分別測(cè)定植株鮮重、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、葉片H2O2、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性。實(shí)驗(yàn)表明,鹽脅迫下,紅麻幼苗生長(zhǎng)的受抑制程度基本上隨脅迫時(shí)間和鹽濃度的增加而加重。葉片中MDA和H2O2的含量也隨脅迫時(shí)間和鹽濃度的增加而增加。SOD活性,在鹽脅迫下波