Apo-B100介導(dǎo)的t-PA基因在雞體內(nèi)表達(dá)及其在卵黃中沉積的研究.pdf

1、人組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator，t-PA)具有高效、特異的溶血栓作用，是目前防治血栓性疾病最有效的藥物之一。Apo-B100是極低密度值蛋白(very low density lipoprotein,VLDLy)組裝前體和正確組裝的必需載脂蛋白。VLDLy是以完整的脂蛋白顆粒通過(guò)卵母細(xì)胞膜上的凹陷小泡以內(nèi)吞的形式進(jìn)入生長(zhǎng)中的卵泡，實(shí)現(xiàn)有機(jī)物在卵黃中的沉積。為探索t-PA在雞卵黃

2、中積淀的可行性，開(kāi)發(fā)具有抗心血管疾病的功能性雞蛋，本研究將t-PA功能區(qū)基因片段△t-PA與雞VLDLy組裝前體apo-B100進(jìn)行融合，構(gòu)建特異性表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞，確證融合基因表達(dá)框架正確后，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染到雞體，對(duì)融合蛋白在雞體內(nèi)的表達(dá)及其在卵黃的沉積進(jìn)行定量、定性、定位的研究，為進(jìn)一步利用家禽作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)t-PA奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，提取高產(chǎn)蛋雞肝臟總RNA，利用設(shè)計(jì)的一對(duì)特

3、異引物，RT-PCR法克隆apo-B100基因片段，通過(guò)蛋白linker與t-PA功能區(qū)片段△t-PA融合，并定向克隆到pCDNA3表達(dá)載體CMV啟動(dòng)子下游，構(gòu)建pCDNA3-apo-△tPA表達(dá)載體，經(jīng)鑒定基因讀碼框架正確后，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)雞胚肝細(xì)胞，ELISA檢測(cè)融合蛋白表達(dá)水平，發(fā)色底物法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性。將pCDNA3-apo-△tPA表達(dá)載體用脂質(zhì)體包裹后，分3次經(jīng)翅下靜脈注入雞體內(nèi)，每次間隔2d，收集不同時(shí)間生產(chǎn)的雞蛋，

4、SDS蛋白電泳和Western bloting檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物；ELISA法檢測(cè)表達(dá)水平；發(fā)色底物法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性；免疫組化法檢測(cè)pCDNA3-apo-△tPA在雞體不同的組織器官的表達(dá)和分布情況。結(jié)果顯示，應(yīng)用RT-PCR克隆的apo-B100基因片段，長(zhǎng)1479bp；apo-B100介導(dǎo)的t-PA融合基因在體外培養(yǎng)的雞胚肝細(xì)胞中能夠表達(dá)并分泌到細(xì)胞外，在48h表達(dá)水平最高，達(dá)675.3ng/106細(xì)胞/24h，表達(dá)產(chǎn)物活性為13

5、5.8IU/106細(xì)胞/24h；卵黃蛋白SDS蛋白電泳和Western bloting檢測(cè)表明，在約84×103KDa處有一條目的蛋白條帶；融合蛋白在質(zhì)粒注射后第3w表達(dá)水平最高，為7.8mg/L，此后呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，至第9w，表達(dá)量仍可維持1.8mg/L；活性檢測(cè)表明，體內(nèi)和體外培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)的融合蛋白均有生物學(xué)活性；通過(guò)對(duì)心臟、肝臟、血管、輸卵管、肌肉、腎臟、等不同的組織免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)融合蛋白在肝臟、肌細(xì)胞分布較多。