支架蛋白IQGAP1對(duì)人食管癌細(xì)胞血管生成的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　1.構(gòu)建IQGAP1基因過(guò)表達(dá)和基因干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系及其對(duì)照細(xì)胞系。
　　2.通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)IQGAP1基因?qū)ρ苌傻挠绊憽?br>　　3.研究IQGAP1對(duì)血管生成影響的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.利用Lipofectamine2000將綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）標(biāo)記的IQGAP1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和它所對(duì)應(yīng)的對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到人食管癌細(xì)胞EC

2、9706，用G418耐藥單克隆細(xì)胞的篩選方法，等到穩(wěn)定生長(zhǎng)后，熒光顯微鏡下觀察其細(xì)胞定位，并通過(guò)Western blot檢測(cè)GFP-IQGAP1融合蛋白的表達(dá)，確定IQGAP1過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。
　　2.利用Lipofectamine2000將IQGAP1干擾質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)人食管癌細(xì)胞KYSE150內(nèi)，采用G418篩選耐藥克隆，待其穩(wěn)定生長(zhǎng)后，熒光顯微鏡下觀察KYSE150細(xì)胞GFP的表達(dá)，并通過(guò)Wester

3、n blot檢測(cè)對(duì)照組與干擾組IQGAP1蛋白的表達(dá)情況，確定IQGAP1干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。
　　3.分別通過(guò)體外 HUVECs小管形成實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)的雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)IQGAP1基因表達(dá)對(duì)腫瘤血管生成的影響。
　　4.采用 Western blot技術(shù)研究 IQGAP1對(duì)食管癌細(xì)胞中 VEGFA與其受體VEGFR2、p-VEGFR2血管生成相關(guān)因子表達(dá)的影響。
　　5.通過(guò)Western blot技術(shù)研究

4、IQGAP1對(duì)Akt和ERK活化的影響。
　　6.在IQGAP1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中加入Akt和ERK抑制劑進(jìn)行干預(yù)處理后，觀察抑制劑對(duì)VEGFA和p-VEGFR2蛋白表達(dá)的影響及對(duì)血管生成的影響。
　　結(jié)果：
　　1.熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染含GFP-IQGAP1重組質(zhì)粒的EC9706細(xì)胞中觀察到其為胞質(zhì)定位； Western blot結(jié)果顯示，在IQGAP1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中有GFP-IQGAP1融合蛋白的表達(dá)，而在其對(duì)照

5、組內(nèi)則沒(méi)有，說(shuō)明IQGAP1過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系已構(gòu)建成功。
　　2.在熒光顯微鏡下可觀察到， GFP在轉(zhuǎn)染IQGAP1干擾質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒的KYSE150細(xì)胞中為全細(xì)胞定位；對(duì)支架蛋白IQGAP1在干擾組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量與其在對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量通過(guò)Western blot進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）。
　　3.體外HUVECs小管形成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，IQGAP1過(guò)表達(dá)組小管生

6、成數(shù)更多，而且所生成小管的管腔結(jié)構(gòu)更加完整，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001），表明IQGAP1過(guò)表達(dá)在體外可以促進(jìn)血管的生成；體內(nèi)雞胚尿囊膜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，IQGAP1過(guò)表達(dá)組生成的血管數(shù)量較對(duì)照組多，并且所生成血管的形態(tài)舒展，顏色較為鮮紅，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），說(shuō)明IQGAP1過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)體內(nèi)血管的生成；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明IQGAP1過(guò)表達(dá)后會(huì)促進(jìn)腫瘤血管的生成。
　　4. IQGA

7、P1干擾組采用體外HUVECs小管生成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，發(fā)現(xiàn)IQGAP1基因干擾后小管生成數(shù)較少，生成小管的管腔結(jié)構(gòu)也不完整，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001），表明IQGAP1干擾后在體外可以抑制血管的生成；體內(nèi)雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IQGAP1基因干擾后所生成的血管數(shù)量較對(duì)照組少，生成的血管色澤灰暗并且主血管較少，經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)得，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；上述體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明干擾IQGAP

8、1基因表達(dá)后能夠明顯抑制腫瘤的血管生成。
　　5.在IQGAP1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，VEGFA與p-VEGFR2蛋白表達(dá)量與其在對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量相比都升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001），而VEGFR2蛋白的表達(dá)量則在IQGAP1過(guò)表達(dá)組與其對(duì)照組細(xì)胞中無(wú)明顯差異，表明IQGAP1可能通過(guò)VEGFA與VEGFR2相互作用后促進(jìn)VEGFR2發(fā)生磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)血管的生成。
　　6.在IQ

9、GAP1干擾組細(xì)胞中，經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，VEGFA與p-VEGFR2蛋白的表達(dá)量與其在對(duì)照細(xì)胞內(nèi)相比，表達(dá)量都降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)方面的意義（P<0.0001），而VEGFR2的表達(dá)量則在IQGAP1干擾組與其對(duì)照組中無(wú)明顯差異，表明IQGAP1可能通過(guò)阻斷了VEGFA與其受體VEGFR2的相互作用進(jìn)而抑制血管生成的過(guò)程。
　　7.經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IQGAP1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中p-Akt、 p-ER

10、K蛋白的表達(dá)量與其在對(duì)照組的結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)量都升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義（P<0.0001）；而IQGAP1干擾組細(xì)胞p-Akt、 p-ERK的表達(dá)量均低于其在對(duì)照組內(nèi)的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）；說(shuō)明IQGAP1對(duì)腫瘤細(xì)胞血管生成的發(fā)生機(jī)制的調(diào)控可能通過(guò)活化Akt和ERK信號(hào)通路發(fā)揮作用的。
　　8.在 IQGAP1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中加入Akt和 ERK抑制劑干預(yù)后， VEGFA和p-VEGFR2蛋白的表達(dá)

11、量顯著降低，并且經(jīng)抑制劑干預(yù)后血管生成數(shù)也降低，說(shuō)明IQGAP1可能通過(guò)AKT或ERK/VEGFA-VEGFR2信號(hào)通路來(lái)影響腫瘤血管生成。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了IQGAP1過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系及IQGAP1干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　2. IQGAP1過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)體內(nèi)外腫瘤的血管生成，而干擾IQGAP1表達(dá)后則會(huì)有效的抑制腫瘤血管的生成。
　　3. IQGAP1對(duì)食管癌中血管生成的作用機(jī)制可能與VEGFA與