非編碼RNAs miR-141-miR-22和PVT1調(diào)控胃癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　最新研究提示lncRNAs參與了癌癥的發(fā)生與進(jìn)程，可以調(diào)控細(xì)胞周期，存活，免疫應(yīng)答，細(xì)胞干性或腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而在腫瘤的發(fā)生與進(jìn)程中發(fā)揮促腫瘤或抑制腫瘤的功能。
　　盡管現(xiàn)階段研究提示非編碼RNAs參與調(diào)控胃癌的發(fā)生與進(jìn)程，但大量非編碼RNAs（miRNAs和lncRNAs）在胃癌中表達(dá)和功能調(diào)控分子機(jī)制仍舊不清楚。闡明非編碼RNAs在胃癌中的作用及其分子機(jī)制，將豐富我們對(duì)胃癌的發(fā)生與進(jìn)程的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也將為胃癌的診

2、斷和治療提供了新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　第一部分:MiR-141靶向調(diào)控TAZ抑制胃癌生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子作用機(jī)制研究
　　1.高通量轉(zhuǎn)錄組芯片測(cè)定4例胃癌患者配對(duì)的癌組織和癌旁組織的miRNAs譜，采用ATC進(jìn)行差異表達(dá)miRNAs的篩選和數(shù)據(jù)挖掘。
　　2.采用qRT-PCR檢測(cè)36例配對(duì)胃癌組織和癌旁組織miR-141表達(dá)水平，比較miR-141在癌組織與癌旁組織的表達(dá)差異，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)

3、分析miR-141與胃癌患者臨床病理轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　3.評(píng)價(jià)miR-141對(duì)胃癌細(xì)胞腫瘤表型的影響。
　　5.采用qRT-PCR檢測(cè)36例配對(duì)胃癌組織和癌旁組織TAZ表達(dá)水平，比較TAZ在癌組織和癌旁組織的差異，并結(jié)合miR-141表達(dá)水平，分析miR-141與TAZ表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　6.評(píng)價(jià)TAZ對(duì)胃癌細(xì)胞腫瘤表型的影響。
　　7.評(píng)價(jià)miR-141對(duì)胃癌體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。
　　第二部分:M

4、iR-22靶向調(diào)控MMP14和Snail抑制胃癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的分子作用機(jī)制研究
　　1.采用qRT-PCR檢測(cè)61例配對(duì)胃癌組織和癌旁組織miR-22表達(dá)水平，比較miR-22在癌組織與癌旁組織的表達(dá)差異。結(jié)合臨床數(shù)據(jù)分析miR-22與胃癌患者臨床病理分期分級(jí)，轉(zhuǎn)移和預(yù)后生存率的相關(guān)性。
　　2.評(píng)價(jià)miR-22對(duì)胃癌細(xì)胞腫瘤表型的影響。
　　3.鑒定miR-22的靶基因。
　　4.采用qRT-PCR檢測(cè)61例配對(duì)

5、胃癌組織和癌旁組織MMP14(Snail)表達(dá)水平，并結(jié)合miR-22表達(dá)水平，分析miR-22與MMP14(Snail)表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　5.評(píng)價(jià)MMP14(Snail)對(duì)胃癌細(xì)胞腫瘤表型的影響。
　　6.評(píng)價(jià)miR-22對(duì)胃癌體內(nèi)生長(zhǎng)、播散和轉(zhuǎn)移的影響。
　　第三部分:長(zhǎng)鏈非編碼RNA PVT1促進(jìn)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究
　　1.高通量轉(zhuǎn)錄組芯片測(cè)定4例胃癌患者配對(duì)的癌組織和癌旁組織的lncRNAs

6、譜，采用ATC進(jìn)行差異表達(dá)lncRNAs的篩選和數(shù)據(jù)挖掘。差異lncRNAs的篩選標(biāo)準(zhǔn)是:P值≤0.05且倍數(shù)改變≥1.5。
　　2.采用qRT-PCR檢測(cè)42例配對(duì)胃癌組織和癌旁組織PVT1表達(dá)水平，比較PVT1在癌組織與癌旁組織的表達(dá)差異，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)分析PVT1與胃癌患者分期分級(jí)、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　3.評(píng)價(jià)PVT1對(duì)胃癌細(xì)胞腫瘤表型的影響。
　　4.評(píng)價(jià)PVT1對(duì)EMT的影響。
　　5.評(píng)價(jià)PVT1對(duì)胃

7、癌體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。
　　6.為證實(shí)PVT1與miR-30a結(jié)合，采用生物信息學(xué)軟件Targetscan預(yù)測(cè)PVT1潛在結(jié)合的miRNAs，RIP和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)鑒定PVT1是否與miR-30a結(jié)合。
　　結(jié)果:
　　第一部分: MiR-141靶向調(diào)控TAZ抑制胃癌生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究結(jié)果
　　1.轉(zhuǎn)錄組芯片篩選16個(gè)miRNAs在癌組織和癌旁組織差異表達(dá)顯著，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，（篩選標(biāo)準(zhǔn):

8、P≤0.05且倍數(shù)改變≥1.5）。
　　2.qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-141在胃癌組織相比較于癌旁組織，其表達(dá)降低，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，且與胃癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　3.CCK-8增殖，劃痕和Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示，miR-141mimics組與mimicscontrol組比，抑制了HGC-27細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。Anti-miR-141組與anti-

9、miR-control組相比，促進(jìn)AGS細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　4.生物信息學(xué)Targetscan預(yù)測(cè)，轉(zhuǎn)錄組mRNA芯片篩選，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-141能夠靶向結(jié)合TAZ3'UTR，表明Hippo通路TAZ是miR-141靶基因。
　　5.TAZ在胃癌組織相比較于癌旁組織，其表達(dá)上調(diào)2.01倍，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)36例胃癌組織中TA

10、Z與miR-141的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.507，P＜0.01)。
　　6.TAZ干擾和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， Si_TAZ組與對(duì)照Si_con組相比，胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力受到抑制，均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與pcDNA3.1空載體組相比，pcDNA3.1-TAZ組胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）?；貜?fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TAZ能夠逆轉(zhuǎn)miR-141對(duì)胃癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)功能表型的抑

11、制。
　　7.裸鼠移植瘤模型顯示，與agomir-NC-HGC-27組相比，agomir-141-HGC-27組的腫瘤體積、質(zhì)量均降低，均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。結(jié)果表明，miR-141能夠抑制體內(nèi)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遠(yuǎn)端肺轉(zhuǎn)移。
　　第二部分:MiR-22靶向調(diào)控MMP14和Snail抑制胃癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究結(jié)果
　　1.qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-22在胃癌組織相比較于癌旁組織，其表達(dá)顯著降低，差異

12、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），且與胃癌的分期分級(jí)，轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　2.CCK-8增殖，劃痕和Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示，miR-22 mimics組與mimicscontrol組比，抑制了SGC-7901細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　3.生物信息學(xué)Targetscan預(yù)測(cè)，轉(zhuǎn)錄組mRNA芯片篩選，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-22能夠靶向結(jié)合MMP14和Snail3'UT

13、R，表明MMP14和Snail是miR-22靶基因。
　　4.相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)61例胃癌組織中MMP14的mRNA表達(dá)水平與miR-22的表達(dá)呈負(fù)向相關(guān)(r=-0.366，P＜0.01);Snail的mRNA表達(dá)水平與miR-22的表達(dá)也呈負(fù)向相關(guān)(r=-0.444，P＜0.01)。
　　5.MMP14和Snail干擾和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Si_MMP14(Snail)組與對(duì)照Si_con組相比，胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力受到

14、抑制，均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　6.裸鼠移植瘤模型顯示，與agomir-NC-SGC-7901組相比，agomir-22-SGC-7901組的腫瘤體積、質(zhì)量均降低，均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　第三部分:長(zhǎng)鏈非編碼RNA PVT1促進(jìn)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究結(jié)果
　　1.轉(zhuǎn)錄組芯片篩選50個(gè)lncRNAs在癌組織和癌旁組織差異表達(dá)顯著，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，（篩選標(biāo)準(zhǔn):P≤0.05且倍

15、數(shù)改變≥1.5）。
　　2.qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PVT1在胃癌組織相比較于癌旁組織，其表達(dá)上調(diào)，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），且與胃癌的分期分級(jí)、轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　3.劃痕和Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示，pcDNA3.1-PVT1組與pcDNA3.1組比，顯著促進(jìn)了AGS細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.免疫熒光，qRT-PCR和免疫印跡結(jié)果顯示，pcDNA3.1-P

16、VT1組與pcDNA3.1組比，過(guò)表達(dá)PVT1抑制了E-cadherin表達(dá)，而促進(jìn)N-cadherin，Snail，ZEB1和ZEB2表達(dá)，提示PVT1影響了EMT相關(guān)分子的表達(dá)。
　　5.裸鼠移植瘤模型顯示，Lv-PVT1組的腫瘤體積、質(zhì)量顯著高于對(duì)照Lv-control組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.生物信息學(xué)Targetscan預(yù)測(cè)，RNA共沉淀和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)PVT1能夠結(jié)合miR-

17、30a，提示PVT1可能發(fā)揮miRNAs分子海綿吸附功能。
　　結(jié)論:
　　第一部分:MiR-141靶向調(diào)控TAZ抑制胃癌生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子作用機(jī)制研究
　　系統(tǒng)篩選鑒定了胃癌相關(guān)miRNAs，確定miR-141是潛在的胃癌抑癌miRNA。其發(fā)揮抑癌作用，至少部分是依賴(lài)于其靶向調(diào)控的Hippo通路組成因子TAZ。
　　第二部分:MiR-22靶向調(diào)控MMP14和Snail抑制胃癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的分子作用機(jī)制研究