神經(jīng)元特異性NSSR1基因敲除對小鼠腦組織發(fā)育的影響.pdf

1、神經(jīng)細(xì)胞特異性絲氨酸/精氨酸富集蛋白(neural salient serine/argininerich protein-1，NSSR1)是迄今發(fā)現(xiàn)的為數(shù)極少的幾種在神經(jīng)組織高表達(dá)的SR蛋白之一，主要參與調(diào)控前體mRNA剪接，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。已有的研究表明，NSSR1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在人和小鼠各組織中廣泛表達(dá)，而其蛋白主要在腦組織中表達(dá)，具有神經(jīng)組織特異性。在培養(yǎng)的細(xì)胞和低等生物體內(nèi)的研究顯示，NSSR1具有促進(jìn)神經(jīng)元分化的作用。提示

2、NSSR1蛋白在腦組織的生長發(fā)育中可能具有重要功能，然而迄今為止，關(guān)于NSSR1在高等生物體內(nèi)(in vivo)功能的研究還很少。鑒于此，本論文的總目標(biāo)是，通過構(gòu)建神經(jīng)元特異性敲除NSSR1基因的小鼠，初步研究NSSR1基因敲除對小鼠腦發(fā)育的影響，從而為研究NSSR1蛋白的在體生理功能奠定基礎(chǔ)。
　　我們首先利用免疫組織化學(xué)的方法觀察野生型(WT)小鼠腦內(nèi)NSSR1蛋白的分布特征，發(fā)現(xiàn)NSSR1蛋白在嗅球(Olfactory Bu

3、lb)、皮層(Cerebral Cortex)、海馬(Hippocampus)、上丘(Superior Colliculus)、下丘(Inferior Colliculus)以及小腦(Cerebellum)中大量表達(dá)，在其他腦區(qū)較少表達(dá)或幾乎沒有表達(dá)。通過NSSR1抗體和NeuN抗體/GFAP抗體免疫共定位，我們觀察到NSSR1蛋白主要在神經(jīng)元中表達(dá)，并且主要在核內(nèi)分布。這些結(jié)果說明，NSSR1的分布具有組織特異性以及細(xì)胞類型特異性的特

4、點(diǎn)。
　　已有研究顯示，全身性敲除NSSR1基因會(huì)導(dǎo)致小鼠的胚胎死亡，提示構(gòu)建條件性敲除NSSR1基因的小鼠對研究其在體功能的必要性。鑒于NSSR1蛋白選擇性地在神經(jīng)元中表達(dá)的特點(diǎn)，我們選擇利用Cre/loxP系統(tǒng)構(gòu)建神經(jīng)元特異性敲除NSSR1基因的小鼠。我們主要通過敲除NSSR1基因的exon3而造成該基因的移碼突變，使蛋白翻譯提前終止，產(chǎn)生無功能的截短型NSSR1蛋白。我們首先構(gòu)建了exon3兩端各有一個(gè)loxP位點(diǎn)的Flox

5、小鼠，并將其與Nse-Cre小鼠雜交，篩選獲得雙轉(zhuǎn)基因的Cre+Flox+/+小鼠。通過基因和蛋白水平的鑒定，證明這種Cre+ Flox+/+小鼠腦組織基因組中exon3被切除，而同時(shí)NSSR1蛋白的表達(dá)量也明顯降低。所以Cre+Flox+/+小鼠即為神經(jīng)元特異性敲除NSSR1基因的小鼠（NSSR1 cKO小鼠），將這一小鼠作為體內(nèi)研究NSSR1蛋白功能的主要模型。
　　在成功構(gòu)建了NSSR1基因條件敲除小鼠（cKO小鼠）的基礎(chǔ)上

6、，我們進(jìn)一步利用該小鼠模型，從小鼠表型、腦的形態(tài)結(jié)構(gòu)、以及小鼠行為學(xué)指標(biāo)等方面對NSSR1蛋白在小鼠腦發(fā)育中的功能進(jìn)行研究。
　　首先我們對不同發(fā)育時(shí)期cKO小鼠和正常小鼠的體重、腦的形態(tài)和重量進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，在出生后1d，7d，14d，21d，1month，2month時(shí)，兩種小鼠的體重沒有顯著性差異，不同發(fā)育時(shí)期兩種小鼠腦的形態(tài)和重量也沒有明顯的差異。即:NSSR1基因的神經(jīng)元特異性敲除沒有引起小鼠個(gè)體表征上的顯著改變。

7、
　　進(jìn)一步，我們利用結(jié)晶紫(CV)、以及成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物NeuN和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP染色小鼠腦片的方法，對cKO小鼠腦的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，和野生型小鼠相比，cKO小鼠腦內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞CV染色變淺，大腦皮層明顯變厚，皮層的神經(jīng)細(xì)胞個(gè)體變小，細(xì)胞間排布更松散。NeuN和GFAP免疫染色的結(jié)果顯示，在cKO小鼠中NeuN的染色變淺，而GFAP染色的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增多，且細(xì)胞胞體增大，突起增多。該研究結(jié)果顯示

8、，NSSR1條件敲除引起了腦內(nèi)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的排布、數(shù)量和胞體特征的改變，這可能是通過影響腦內(nèi)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化或成熟來實(shí)現(xiàn)的。
　　為進(jìn)一步探索NSSR1基因敲除是否影響小鼠腦內(nèi)細(xì)胞增殖、凋亡、分化或成熟，我們針對不同發(fā)育階段的神經(jīng)元標(biāo)記物DCX和MAP2對小鼠腦片進(jìn)行免疫組織（熒光）化學(xué)分析，結(jié)果顯示，和同窩對照小鼠相比，cKO小鼠視皮層DCX標(biāo)記的幼稚神經(jīng)元數(shù)目增多，整個(gè)皮層MAP-2標(biāo)記的神經(jīng)元樹突密度減少、長度

9、變短。而在海馬區(qū)，DCX標(biāo)記的熒光信號(hào)減弱，且細(xì)胞突起的長度變短，而MAP2標(biāo)記的成熟神經(jīng)元的突起反而增加。
　　鑒于海馬是小鼠學(xué)習(xí)記憶的主要腦區(qū)，我們進(jìn)一步用水迷宮和新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)研究了NSSR1基因敲除對小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，結(jié)果顯示，和同窩對照小鼠相比，NSSR1 cKO小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和對新物體的識(shí)別能力都有顯著降低。
　　綜上所述，本論文在成功構(gòu)建NSSR1基因神經(jīng)元特異性敲除小鼠的基礎(chǔ)上，從小鼠腦的形態(tài)結(jié)構(gòu)和