低強度脈沖超聲促進骨髓間充質干細胞增殖及其機制的初步探討.pdf

1、組織工程的核心是運用工程科學與生命科學的原理和技術,研究與開發(fā)具有生命力且與機體病損組織或器官形態(tài)和功能相一致的生物體,以期恢復、維持和改善相關組織或器官形態(tài)和功能的一門新興學科。迄今,國內外組織工程研究已取得令人矚目的研究成果,展現(xiàn)了修復與重建外科應用的美好前景。
　　 組織工程化組織或器官能否構建成功,種子細胞的選擇、處理和應用成為了組織工程技術中需要解決的關鍵問題,無論采用何種種子細胞構建組織工程化組織或器官都需要大量的種

2、子細胞。種子細胞的擴增要求提高擴增效率,短時間內獲取足夠數(shù)量的細胞,因此組織工程對擴增種子細胞的技術手段要求較高。種子細胞的數(shù)量不足成為了組織工程產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的制約因素。針對此問題,主要的解決手段及其不足有:(1)生長因子的應用:致基因突變的危險性大,量效關系不清；(2)改善種子細胞培養(yǎng)體系:存在諸多技術上的缺陷,難以完全模擬體內微環(huán)境,且費用昂貴；(3)轉基因技術:轉染效率低,體內表達時間短。上述擴增種子細胞的方法都存在各自的弊端及不完

3、善之處,因此越來越多的學者都在尋求一種更為有效的技術手段。
　　 低強度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)的發(fā)射方式為脈沖式,且劑量可低至30mw/cm2以下,對人體組織不會有損傷。目前,LIPUS已經(jīng)廣泛應用于骨與軟組織創(chuàng)傷的愈合,使用安全,效果顯著。近年來隨著對LIPUS諸多研究的展開,LIPUS在其他領域的應用也越來越受到重視,特別是其在細胞生物學方面的重要作用,能促進體

4、外成纖維細胞、成骨細胞等細胞的增殖和細胞外基質的分泌。而現(xiàn)在種子細胞應用的較多的是骨髓間充質干細胞,由此,本課題將LIPUS和骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)結合起來,探索能否找到體外擴增組織工程的種子細胞的新途徑。
　　 目的：
　　 1.觀察LIPUS在不同培養(yǎng)條件下(正常干細胞培養(yǎng)體系和低血清培養(yǎng)體系)對BMSCs增殖的影響,探討LIPUS在組織工程中擴增種子細

5、胞的可行性。
　　 2.探索LIPUS影響B(tài)MSCs增殖的機制,為LIPUS促進BMSCs的增殖提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.為篩選后續(xù)研究的最佳細胞接種密度,將第三代BMSCs以3×103個/ml,5×103個/ml,1×104個/ml,5×104個/ml四種密度各接種于16塊6孔板中,2ml/孔,每板1、2、3號孔為超聲照射組(LIPUS組),4、5、6號孔為空白對照組。采用100mw功率的脈沖超聲

6、照射,脈沖寬度為800ms,脈沖間歇為200ms,超聲照射組每天每孔照射20min。每天鏡下觀察細胞生長情況,于照射前、照射后1d、3d、5d行MTT檢測。
　　 2.(1)將正常干細胞培養(yǎng)體系下的第三代BMSCs以篩選出的最佳的觀察密度--1×104個/ml密度接種于16塊6孔板中(2ml/孔),隨機分為LIPUS組和空白對照組,每組8個板,照射方案及檢測方法同前；(2)將第三代BMSCs接種于一次性培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),并分為LIP

7、US組、空白對照組,每天每瓶照射20min,并于照射前、照射后1d、2d、3d、4d、5d、6d、8d、10d行流式細胞儀檢測細胞周期變化。
　　 3.(1)采用胎牛血清含量為5ml/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)第三代的BMSCs,將大部份BMSCs的細胞周期阻滯在G0/G1期狀態(tài)；(2)將所培養(yǎng)的BMSCs以1×104個/ml接種于16塊6孔板中,隨機分為LIPUS組和空白對照組,每組8個板,照射方案及檢測方法同前:(3)將低血清培養(yǎng)條件下

8、的BMSCs接種于一次性培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),并分為LIPUS組、空白對照組,照射方案同前,并于照射前,照射后1d、3d、5d行流式細胞儀檢測細胞周期變化。
　　 4.將正常干細胞培養(yǎng)體系下和低血清培養(yǎng)體系下培養(yǎng)的第三代BMSCs接種于一次性培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),分組及照射方案同前,并于照射前、照射后1d、3d、5d、7d行RT-PCR檢測各組細胞Bmi-1基因mRNA的表達指數(shù)；并同時檢測原代BMSCs的Bmi-1基因mRNA的表達。

9、　　 結果：
　　 1.形態(tài)學觀察示:各密度組細胞均呈長梭形,多角形,折光性強。3×103組:照射前、照射后各天鏡下觀察LIPUS組和空白對照組的細胞均散在分布,集落稀疏,觀察兩組細胞生長情況無明顯差異；5×103組:鏡下觀察LIPUS組于照射1d后細胞即形成簇狀增生灶,而空白對照組細胞仍呈單個散在生長,照射3d、5d后鏡下觀察LIPUS組和空白對照組細胞均呈簇狀生長,但LIPUS組細胞集落更為密集；1×104組:LIPUS組

10、于照射后各天細胞分裂增殖較空白對照組活躍,細胞增多呈漩渦狀緊密排列,細胞集落密集；5×104組:鏡下觀察LIPUS組于照射后1d、3d細胞分裂增殖較空白對照組活躍,細胞集落密集,照射5d后兩組細胞集落密集程度相似。MTT檢測示:3×103組:LIPUS組和空白對照組細胞增殖活性在各檢測時間比較均無差異性,無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；5×103組:LIPUS組和空白對照組細胞增殖活性在0d、5d比較無差異性(P>0.05),1d、3d

11、LIPUS組細胞增殖活性高于空白對照組,有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；1×104組:LIPUS組于照射后各檢測時間細胞增殖活性明顯高于空白對照組(P<0.05)；5×104組:細胞生長較快,MTT檢測兩組細胞增殖活性無明顯差異性(P>0.05)。觀察各密度組細胞增殖活性曲線,1×104組BMSCs增殖曲線較穩(wěn)定,故定為后續(xù)研究的最佳鋪板密度。
　　 2.形態(tài)學觀察:LIPUS組于照射后各天細胞分裂增殖較空白對照組明顯活躍,細胞集

12、落更為密集；MTT檢測表現(xiàn)為:LIPUS組于照射后1d、3d、5d的細胞增殖活性均明顯高于空白對照組(P<0.05)；流式細胞儀檢測細胞周期顯示:LIPUS組于照射后各天的細胞增殖率(S+G2％)均明顯高于空白對照組(P<0.05)；LIPUS組的細胞增殖率最高可高出空白對照組113.2％,最低為21.1％,LIPUS組增殖率平均要高出空白對照組40.9％。
　　 3.形態(tài)學觀察顯示:兩組細胞形態(tài)寬大、扁平,透光性增強,LIPU

13、S組于照射后細胞生長較空白對照組活躍,覆蓋板底面積較空白對照組大；MTT顯示LIPUS組于照射后在各檢測時間細胞增殖活性明顯高于空白對照組(P<0.05)；流式細胞儀檢測示:LIPUS組于照射后1d、3d、5d細胞增殖率顯著高于空白對照組(P<0.05)
　　 4.在不同培養(yǎng)體系下,LIPUS組Bmi-1基因mRNA表達均高于空白對照組(P<0.05)；正常培養(yǎng)條件下LIPUS組Bmi-1基因mRNA表達明顯高于低血清培養(yǎng)狀態(tài)下

14、LIPUS組和原代BMSCs(P<0.05),低血清培養(yǎng)狀態(tài)下LIPUS組的Bmi-1基因mRNA表達亦高于原代BMSCs(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.細胞接種密度為1×104個/ml更便于長時間的研究和觀察。
　　 2.提示LIPUS對BMSCs增殖具有促進作用,并能有效地促進靜止期的BMSCs進入分裂期。
　　 3.LIPUS對低血清培養(yǎng)體系下的BMSCs的增殖也具有顯著的促進作用。