低氧促進人骨髓間充質干細胞增殖和分化及其機制研究.pdf

1、氧是維持生命的必要條件，也是細胞功能的一種重要生理調節(jié)因子，而低氧是生命發(fā)育的基本環(huán)境。例如，在妊娠的早期，由于沒有血管的形成，所以胚胎是在低氧環(huán)境中發(fā)育的。低氧作為一種生理性的刺激因素，影響著胚胎的發(fā)生、發(fā)育及正常功能的維持。低氧可激活低氧誘導因子(HIF)，從而調控一系列與低氧相關基因的表達。例如，誘導與葡萄糖分解、轉運、紅細胞和血管再生等相關的基因，使其表達增加，從而維持體內氧環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。關于低氧作用的研究，目前多集中在低氧對細胞

2、的損傷和有關的適應機制方面，而對低氧在細胞增殖、分化中影響的研究較少。特別是對于體內胚胎發(fā)生時期和成年后的一些生理、病理過程中，出現細胞局部微環(huán)境低氧的情況重視不足。干細胞包括骨髓間充質干細胞(MSCs)體外培養(yǎng)和增殖分化作用的研究都是在常氧(20％O2)條件下進行的，這樣難以反映體內的真實情況。低氧在體內作為一種生理性的刺激因素，對體外培養(yǎng)的MSCs增殖和分化的作用目前還不清楚，也沒有引起科研人員的足夠重視。而人骨髓間充質干細胞(hM

3、SCs)是目前臨床應用前景最好的成體干細胞，因此，本文就低氧對hMSCs體外增殖和分化作用進行了初步研究。 1.低氧對hMSCs體外增殖的作用探討不同方式低氧對hMSCs體外增殖的影響。實驗采用血球計數板計數法和流式細胞術分別觀察了間歇性低氧(3％O2、10％O2)和持續(xù)性低氧(3％O2、10％O2、100μmol/LCoCl2、200μmol/LCoCl2)對hMSCs數量以及增殖指數的影響。結果發(fā)現，間歇性低氧對hMSCs數

4、量和增殖指數無明顯影響；持續(xù)性低氧各組hMSCs數量和增殖指數均增加(P＜0.05)。提示持續(xù)性低氧可促進體外培養(yǎng)的hMSCs增殖，說明持續(xù)性低氧作為體外的一種可控制因素，可調節(jié)hMSCs的體外增殖，對于hMSCs的臨床應用具有一定的意義。 同時本研究還應用基因芯片技術分析了低氧對hMSCs增殖過程中基因表達譜的變化。結果顯示21329個基因中282個基因有差異性表達。從基因學的角度證實了低氧對hMSCs增殖的影響是一個多基因參

5、與的復雜過程。并從基因芯片的結果中篩選出5個目的基因，用RT-PCR方法檢測了這5個基因的表達變化。發(fā)現在常氧環(huán)境中培養(yǎng)的hMSCs有HIF-1αmRNA的表達，hMSCs在持續(xù)性低氧3d內其HIF-1αmRNA的表達均無明顯變化。提示持續(xù)性低氧促進hMSCs的增殖可能是通過非HIF-1通路的作用。 2.低氧對hMSCs體外誘導分化的作用2.1β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，BME)誘導hMSCs向神經元樣細胞

6、方向分化的方法建立常規(guī)培養(yǎng)的hMSCs，以2×105/皿密度接種于涂有纖維結合素的35mm培養(yǎng)皿中，隨機分成兩組：對照組和分化組。分化組于接種24h后更換培養(yǎng)液，加入預誘導液預誘導24h；之后更換培養(yǎng)液，再加入誘導液誘導5h。結果顯示：hMSCs經BME的誘導可向神經元樣細胞方向分化，并且，此方法穩(wěn)定可靠。 2.2低氧對BME誘導hMSCs向神經元樣細胞方向分化的影響實驗分三組：對照組、常氧分化組和低氧分化組。后兩組誘導方法同上

7、，低氧分化組是在3％O2的環(huán)境下進行預誘導和誘導。鏡下觀察低氧分化組hMSCs轉變?yōu)樯窠浽獦有螒B(tài)的明顯多于常氧分化組；免疫組化顯示，低氧分化組TH染色陽性細胞數為(24.8±1.2)％，明顯高于常氧分化組(8.6±0.3)％，統(tǒng)計有顯著性差異(P＜0.001)。 2.3低氧對BME誘導hMSCs分化的細胞多巴胺及其代謝產物含量的影響應用HPLC測定細胞內外DA和HVA的含量。檢測出常氧分化組和低氧分化組DA遞質及其代謝產物HVA

8、，對照組則未被檢測出DA和HVA。常氧分化組和低氧分化組細胞內DA含量均高于細胞外(前者P＜0.05，后者P＜0.01)，而HVA則細胞外均高于細胞內(二者P＜0.001)。低氧分化組DA總含量和HVA總含量均增高，與常氧分化組之間有統(tǒng)計學意義(前者P＜0.01，后者P＜0.05)。以上結果提示，低氧可促進hMSCs向多巴胺能神經元細胞的方向分化。 2.4低氧對誘導前后HIF-1α、THmRNA和HIF-1α蛋白表達的影響在預誘

9、導不同時間點4h、8h、12h、24h和誘導2h、5h時同時提取三組細胞的總RNA，進行RT-PCR，結果顯示，在常氧環(huán)境下培養(yǎng)的hMSCs即有HIF-1αmRNA表達，常氧分化組和低氧分化組不同時間點HIF-1αmRNA的表達無明顯變化；對照組細胞不表達THmRNA，常氧分化組預誘導8h時有THmRNA表達，到誘導2h時THmRNA表達的灰度明顯升高。低氧分化組預誘導4h時即有THmRNA表達，之后THmRNA表達的灰度無明顯變化。

10、 在預誘導24h和誘導2h、5h時同時收集三組細胞，提取細胞總溶解蛋白，以β-actin作為內參，進行Western蛋白免疫雜交。結果顯示，對照組無HIF-1α蛋白表達，常氧分化組預誘導24h時有HIF-1α蛋白表達，低氧分化組預誘導24h時HIF-1α蛋白表達量高于常氧分化組，誘導2h、5h時兩個分化組細胞不表達HIF-1α蛋白。以上結果提示，低氧促進hMSCs向多巴胺能神經元細胞的方向分化可能是通過HIF-1的通路實現的。