IGF1R基因沉默對梅花鹿鹿茸軟骨細胞增殖周期凋亡等作用研究.pdf

1、鹿茸是梅花鹿第二顯著性征，具有周期性再生的特性。在它生長最旺盛時期，其生長速度可達到2cm/d。已有的研究表明:鹿茸的再生是一個基于鹿茸干細胞代謝且受多種因子調(diào)控的復雜過程，此外有大量研究報道IGF1R基因參與多種細胞的增殖與代謝。然而，IGF1R基因在鹿茸軟骨細胞的研究鮮有報道，因此本試驗旨在從鹿茸軟骨細胞生長、增殖、周期和凋亡的角度探究IGF1R的功能，為進一步深入研究鹿茸生長發(fā)育分子機理提供新的觀點。本試驗采用RNAi技術干擾鹿茸

2、軟骨細胞IGF1RmRNA的表達，從不同角度分析其對軟骨細胞的影響。
　　本研究以RNAi-Ready pSIREN-RetroQZsGreen plasmid為載體，以IGF1R作為候選基因研究其對鹿茸軟骨細胞生長的調(diào)控機制，成功構建了2個RNAi重組質粒，分別命名為p shRNA-1和pshRNA-2，用于轉染軟骨細胞。利用Real-Time PCR和Western blot技術，對轉染48h后的RNAi效果進行分析。研究IG

3、F1R對鹿茸軟骨細胞增殖、凋亡及自身mRNA和蛋白表達的調(diào)控，進一步探討鹿茸生長調(diào)節(jié)機制。研究內(nèi)容和結果如下:
　　(1)轉染軟骨細胞48h，相比陰性對照組，軟骨細胞經(jīng)pshRNA-1和pshRNA-2處理，IGF1R基因mRNA表達量分別為51％和75％;蛋白質的表達量也有明顯下降。表明干擾細胞效果明顯。
　　(2)采用CCK-8方法檢測轉染24h、48h和72h后細胞增殖情況。相比于陰性對照組，試驗組的細胞增殖呈下降趨勢

4、，尤其是pshRNA-1質粒干擾效果明顯((1.09士0.10 vs1.16士0.09(P＜0.01),1.04土0.02 vs1.10±0.06(P＜0.05),0.79±0.06 vs1.01±0.07(P＜0.01))。
　　(3)轉染軟骨細胞48h，相比于陰性對照組pshRNA-negative，試驗組細胞更多的處于G1期（79.47±0.11vs82.27±0.35（P＜0.01）），而S期細胞數(shù)量顯著下降(16.56±

5、0.10 vs14.82±0.014(P＜0.05))。
　　(4)轉染軟骨細胞48h后，試驗組pshRNA-1和陰性對照組pshRNA-negative的早期凋亡水平分別為(22.12±2.72％ vs8.56±0.16％，P＜0.01);正?；罴毎謩e為（62.85±5.97 vs77.39士4.46，P＜0.05）。相關凋亡基因p53(P＜0.01)、bcl-2(P＜0.05)和bax的表達水平顯著下降(P＜0.01)。表明