淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖、分泌及MAPKs通路的影響.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨類疾病作為一類嚴重影響動物及人類健康的疾病，成為當今醫(yī)學、科學及社會普遍關(guān)注的問題。這類疾病的發(fā)生發(fā)展主要是由于各種致病因子作用于機體，導致軟骨組織損傷所致，但因為關(guān)節(jié)部位的特殊解剖學結(jié)構(gòu)，使得當前預(yù)防和治療該病較為棘手。淫羊藿甙作為淫羊藿的主要單體之一，現(xiàn)代科學研究發(fā)現(xiàn)其能夠通過激活細胞MAPKs通路而促進成骨細胞及軟骨細胞的增殖、分化，抑制細胞凋亡，從而對骨損傷具有著明顯的改善作用。但淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細胞的作用及作用機制尚

2、完全清楚，因此本試驗借助細胞培養(yǎng)、組織學、免疫組織化學、流式細胞儀等技術(shù)來研究淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖、凋亡及NO/NOS、MMP-13分泌的影響。同時運用Western-Blot技術(shù)探究淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細胞MAPKs通路的作用及調(diào)控機理，從而為臨床應(yīng)用淫羊藿甙防治軟骨細胞類疾病提供相應(yīng)的科學依據(jù)。
　　 本試驗以健康豬的膝關(guān)節(jié)為材料，利用酶消化法分離培養(yǎng)了豬的關(guān)節(jié)軟骨細胞，建立了豬關(guān)節(jié)軟骨細胞的高效體外培養(yǎng)方法。同時利用細

3、胞學、HE染色、Ⅱ型膠原免疫組化及超微結(jié)構(gòu)觀察等方法對分離培養(yǎng)的細胞進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)采用酶消化法分離培養(yǎng)的細胞長勢良好，形態(tài)、密度正常，可用于本試驗的研究工作。
　　 MTT法檢測淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細胞的作用發(fā)現(xiàn):終濃度為1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL和40ng/mL的淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖均有促進作用。但隨著培養(yǎng)時間的增加(1d、3d、5d、7d)，各濃度淫羊藿甙對細胞增殖的促進作用也有所變

4、化:低、中濃度淫羊藿甙的促進作用越來越顯著(P＜0.05)，而高濃度的促進作用較之下降。在關(guān)節(jié)軟骨細胞整個生長曲線上，濃度為10ng/mL的淫羊藿甙對其增殖有較好的促進作用，因此本試驗就以終濃度為10 ng/mL的淫羊藿甙作為對關(guān)節(jié)軟骨細胞的最適濃度進行后續(xù)研究。
　　 終濃度為10ng/mL的淫羊藿甙作用于關(guān)節(jié)軟骨細胞，流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡的結(jié)果顯示:作用1d時可引起細胞G1期阻滯(P＜0.05)，但加入淫羊藿甙3d、

5、5d、7d的細胞，周期無明顯變化(P＞0.05);而淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡無明顯作用(P＞0.05)，因此認為淫羊藿甙有利于關(guān)節(jié)軟骨細胞的生長增殖。
　　 利用比色法檢測NO/NOS的結(jié)果發(fā)現(xiàn):關(guān)節(jié)軟骨細胞在終濃度為10ng/mL的淫羊藿甙作用5d時，NO和NOS的分泌顯著減少(P＜0.05);利用ELISA方法檢測MMP-13發(fā)現(xiàn):作用3d、5d、7d時關(guān)節(jié)軟骨細胞分泌MMP-13顯著下降(P＜0.05)，由此表明淫羊藿

6、甙可以明顯調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨細胞多種分解因子的分泌。
　　 Western-blot試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):終濃度為10ng/mL的淫羊藿甙加入關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)1d、3d、5d、7d，各試驗組分別在培養(yǎng)時間結(jié)束前5min、25min、1.5h加入淫羊藿甙后ERK1/2通路磷酸化蛋白水平無顯著差異(P＞0.05)，但在5min和25min時試驗組的ERK1/2通路磷酸化蛋白水平顯著高于對照組(P＜0.05)，說明淫羊藿甙加入1d～7d ERK1/

7、2通路磷酸化蛋白的表達無明顯變化，且可以在短時間之內(nèi)(5min)快速激活通路并維持通路的激活狀態(tài)達1.5h。此外淫羊藿甙對p38通路的激活作用不如激活ERK1/2通路快速，25min后才達到激活高峰，且維持時間也較短，1.5h磷酸化蛋白表達水平已顯著低于25min的表達水平(P＜0.01)。因此認為淫羊藿甙作用于關(guān)節(jié)軟骨細胞時能在短時間內(nèi)激活MAPKs通路并維持其激活狀態(tài)，且對ERK1/2通路的激活速度要快于對p38通路。