Neuroleukin在關節(jié)軟骨的表達及其對軟骨細胞增殖和基質分泌影響的研究.pdf

1、關節(jié)軟骨是由軟骨細胞和細胞外基質構成的無血管組織，由于沒有血供，自身修復能力較差，關節(jié)軟骨損傷的修復一直是關節(jié)外科的治療難題。盡管用于臨床治療軟骨缺損的手段很多，但是遠期效果都不很理想，而且關節(jié)軟骨的增殖能力差，長期的體外培養(yǎng)擴增時間均導致了軟骨細胞的體外去分化，從而形成無功能性的纖維軟骨，大大影響了組織工程軟骨的修復效果。Neuroleukin是一種神經(jīng)生長因子，也是一種自分泌運動因子(Autocrine motility facto

2、r AMF)，雖然Neuroleukin/AMF在血管內皮細胞和成纖維細胞僅有少量研究，但是目前普遍認為Neuroleukin/AMF是一種腫瘤細胞所特異性分泌，并與腫瘤的侵襲，轉移，增殖和血管生成相關的多功能蛋白，它同時也作為（Glucose-6-phosphate isomerase GPI）存在于細胞內調節(jié)細胞糖代謝。大量研究證明Neuroleukin的這種功能都是通過他的胞膜受體AMFR來介導實現(xiàn)的。然而NLK作為一種多功能蛋白

3、，其在軟骨細胞的功能卻沒有報道。在本研究中，我們探究并證實了AMFR和Neuroleukin在軟骨細胞的表達，并且發(fā)現(xiàn)Neuroleukin/AMFR表達和關節(jié)軟骨細胞成熟和分化的有關;并且發(fā)現(xiàn)NLK能夠促進軟骨細胞的增殖以及Ⅱ型膠原分泌，另外，信號通路的檢測證明NLK對軟骨細胞的這些作用很可能是通過PI3K和Smads通路介導的。
　　本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)了Neuroleukin作為一種生理性細胞因子存在并被軟骨細胞分泌，發(fā)現(xiàn)N

4、LK的表達和軟骨細胞的分化，成熟有關;而且能夠作為細胞外因子通過其胞膜受體AMFR在軟骨細胞上也能夠行使其促進增殖和分泌基質的功能;我們的結果表明Neuroleukin可能用于自體軟骨移植ACI的輔助治療或者細胞注射等治療手段，可能為軟骨組織工程帶來新的治療途徑。
　　實驗一 Neuroleukin及其受體在關節(jié)軟骨的表達
　　目的:研究Neuroleukin和其受體AMFR/gp78在關節(jié)軟骨細胞的表達。
　　方法:

5、選擇1月齡大鼠軟骨細胞原代培養(yǎng)，利用Western blot檢測并且以腫瘤細胞系(B16-F1，HT1080)和血管內皮細胞系，成纖維細胞系(HUVEC，NIH3T3)作為對照探究NLK在軟骨細是否存在，檢測正常軟骨細胞能否分泌NLK;利用免疫組化方法和免疫熒光/激光共聚焦觀察AMFR在細胞膜的表達情況，分析不同月齡大鼠的關節(jié)軟骨組織內NLK和AMFR的表達差異。
　　結果:Western blot表明NLK生理性存在于軟骨細胞，

6、而且NLK/AMFR在腫瘤細胞相對于正常細胞呈現(xiàn)明顯高表達;免疫組化表明AMFR存在于軟骨細胞膜，并且表層關節(jié)軟骨的表達遠高于肥大軟骨細胞的表達;Western blot同樣證明NLK不僅能夠被腫瘤細胞分泌，也能夠被軟骨細胞生理性分泌;NLK/AMFR的表達量在1周-4月大鼠關節(jié)軟骨發(fā)育期逐漸增高，而在4月-12月隨著關節(jié)的成熟和老化退變，其表達量逐漸下降。
　　結論:Neuroleukin作為一種生理性細胞因子存在并被關節(jié)軟骨細

7、胞分泌，其膜受體AMFR/gp78也被軟骨細胞表達;NLK和其受體AMFR/gp78的表達量隨著幼齡大鼠關節(jié)軟骨發(fā)育的成熟/老齡大鼠關節(jié)軟骨的老化退變而逐漸上升/下降。
　　實驗二 Neuroleukin對大鼠體外關節(jié)軟骨細胞增殖能力的影響
　　目的:研究NLK對軟骨細胞增殖能力的影響和其機制。
　　方法:設計濃度梯度微流控芯片以觀察不同濃度NLK對軟骨細胞增殖能力的影響并探究最佳有限濃度，在6天的連續(xù)培養(yǎng)中觀察NLK

8、能否促進軟骨細胞的增殖，并作NLK促增殖作用的最佳濃度篩選;觀察在NLK作用下連續(xù)培養(yǎng)6天后軟骨細胞的形態(tài)有無變化。進行細胞周期分布檢測，檢測NLK對軟骨細胞周期分布的影響并分析;Western blot檢測NLK作用條件下AMFR的表達情況和PI3K-Akt，MAPK通路及其下游的周期蛋白的表達。
　　結果:NLK能夠通過AMFR促進軟骨細胞的增殖，并且在NLK作用下連續(xù)培養(yǎng)6天后軟骨細胞的形態(tài)沒有明顯變化，NLK對軟骨細胞的促

9、增殖作用在一定濃度范圍內有濃度依賴性升高，在12.85ng/ml時達到最佳有效濃度;NLK促進增細胞周期中增殖軟骨細胞的比例，表現(xiàn)為NLK作用條件下S期，G2M期比例升高。NLK的作用明顯上調了其受體AMFR在軟骨細胞的表達水平，并且NLK通過提高Akt和ERK的磷酸化水平從而影響其下游細胞周期蛋白來促進軟骨細胞增殖。
　　結論:NLK能夠通過調控PI3K-Cyclin促進關節(jié)軟骨細胞的體外增殖，NLK的增殖作用是通過NLK/AM

10、FR激活PI3K-Akt及其下游的cyclin蛋白實現(xiàn)的。
　　實驗三 Neuroleukin對大鼠體外關節(jié)軟骨細胞基質蛋白分泌的影響
　　目的:研究NLK對關節(jié)軟骨細胞基質蛋白分泌的影響和其機制。
　　方法:設計引物通過Realtime PCR手段檢測軟骨細胞的特異性基質Ⅱ膠原蛋白和蛋白多糖在48小時Neuroleukin作用下的mRNA表達水平的變化;并以低血清培養(yǎng)基組作為對照組，通過western blot和免疫

11、熒光檢測蛋白水平Ⅱ型膠原蛋白在NLK作用下48小時及P0-P1連續(xù)培養(yǎng)時的表達;通過western blot及免疫熒光檢測p-Smad2/3和p-Smad1/5/8蛋白在Neuroleukin作用后的磷酸化水平的變化。
　　結果:Realtime PCR表明Neuroleukin48小時作用下，Ⅱ型膠原蛋白mRNA表達水平較對照組明顯升高，而蛋白多糖GAGs表達的mRNA水平無顯著變化;同樣NLK作用48小時Ⅱ型膠原蛋白表達明顯升