檢測(cè)動(dòng)物皮毛中6種致病菌的基因芯片技術(shù)研究.pdf

1、本研究根據(jù)WHO、OIE等權(quán)威機(jī)構(gòu)公布的各國(guó)疾病流行情況和相關(guān)的文獻(xiàn)資料，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室病原分離、鑒定結(jié)果，以動(dòng)物皮毛中常見(jiàn)的6種致病菌布氏桿菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、丹毒桿菌、銅綠假單胞桿菌等為研究對(duì)象，選擇16srDNA基因和gyrB基因進(jìn)行序列分析，設(shè)計(jì)兩對(duì)通用引物和相應(yīng)的多條細(xì)菌鑒別探針，研究同時(shí)檢測(cè)6種致病菌的基因芯片檢測(cè)方法，并進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用效果評(píng)價(jià)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.在對(duì)動(dòng)物皮

2、毛攜帶布氏桿菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、丹毒桿菌、銅綠假單胞桿菌等鑒定的基礎(chǔ)上，采用CTAB法，酚氯仿法、Na(I)法和NaOH-SDS法分別提取6種致病菌的核酸，比較提取核酸含量、純度和完整性，發(fā)現(xiàn):酚氯仿法可作為基因芯片檢測(cè)的通用核酸提取方法。
　　2.選擇在細(xì)菌生物學(xué)上具有重要意義的16s rDNA基因和gyrB基因，對(duì)6種致病菌的序列分析后分別設(shè)計(jì)2對(duì)通用引物和對(duì)應(yīng)的1～5條特異性寡核苷酸探針，

3、每條上游引物標(biāo)記TAMARA熒光基團(tuán)。使用芯片點(diǎn)樣液將各個(gè)探針稀釋為30μmol/L，點(diǎn)樣制備檢測(cè)基因芯片，每個(gè)矩陣為18×10陣列（行×列），每條探針5個(gè)重復(fù)點(diǎn)。建立每種細(xì)菌基于16s rDNA基因和gyrB基因的通用不對(duì)稱(chēng)的PCR方法，其產(chǎn)物與制備基因芯片雜交，優(yōu)化并建立同時(shí)檢測(cè)6種致病菌的基因芯片方法。結(jié)果表明:基因芯片最佳反應(yīng)條件為使用47％甲酰胺雜交液，42℃雜交4h。該芯片的檢測(cè)方法特異性好，僅與布氏桿菌、大腸桿菌O157、