利用RNA干擾誘導ACE基因沉默治療自發(fā)性高血壓大鼠的研究.pdf

1、高血壓是充血性心衰、中風、終末期腎病的重要危險因子。尋找一種長期有效的、通過調節(jié)體內基因表達而控制高血壓的方法即基因治療一直是醫(yī)學家們努力的目標和方向。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術是近年發(fā)展起來的基因阻斷技術，該技術通過雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)的介導，在酶的作用下產生大量的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，特異性降解與

2、之序列同源的mRNA，導致轉錄后水平的基因沉默。研究表明當siRNA呈短發(fā)夾狀RNA(short hairpin RNA，shRNA)時，其基因沉默效應更強。本實驗即利用先進的RNA干擾技術，選擇與高血壓病發(fā)生發(fā)展密切相關的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin.angiotensin system，RAS)中的血管緊張素轉換酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)為靶點，構建ACE-shKNA的表達載體，分別

3、在體外和體內實驗中運用該技術抑制ACE mRNA的表達，從而探索其在高血壓治療中的應用前景。 方法： 1.構建靶向抑制大鼠ACE基因的shRNA真核表達載體：首先在GenBank上選取大鼠ACE mRNA序列，根據(jù)siRNA設計原則，設計兩條靶序列，并進行BLAST驗證。然后合成靶序列單鏈并退火形成雙鏈，與線性化pGenesil-1質粒載體連接，進行酶切和測序鑒定。構建的兩個重組質粒分別命名為pACE-shRNA1與pA

4、CE-shRNA2。 2.質粒pACE-shRNA轉染大鼠血管內皮細胞條件的優(yōu)化：①植塊法原代培養(yǎng)大鼠血管內皮細胞：將Wistar大鼠(體重120～150g)頸椎脫臼處死，無菌狀態(tài)下取出其胸、腹主動脈，剪切成約1mm×1mm大小的血管片，內膜面壁貼于培養(yǎng)瓶內，在含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進行大鼠動脈血管內皮細胞的原代和傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察內皮細胞的形態(tài)和生長特性，并進行血管內皮細胞中Ⅷ因子相關抗原(von Will

5、ebrandfactor，vwF)的檢測鑒定。②用不同比例的質粒pACE-shRNA與脂質體轉染劑METAFECTENE的復合物轉染大鼠血管內皮細胞。因質粒中含有綠色熒光蛋白的報告基因，故轉染后48小時可在熒光顯微鏡下觀察熒光表達并計算轉染效率，同時用MTT法檢測細胞存活率，尋求轉染效率較高且細胞毒性較低的pACE-shRNA與METAFECTENE的最佳配比。 3.質粒pACE-shRNA抑制大鼠血管內皮細胞ACE表達的研究：

6、用pACE-shRNA與METAFECTENE的最佳配比復合物轉染大鼠血管內皮細胞，分別于轉染前及轉染后的24h、48h、72h收集細胞，用RT-0PCR及Westem blot法檢測ACE mRNA及相應功能蛋白的表達。大鼠血管內皮細胞分為四組：①空白對照組(細胞內不加任何干擾因素)；②質粒對照組(細胞轉染對照質粒)；③pACE-shRNAl組(細胞轉染pACE-shRNAl)；④pACE-shRNA2組(細胞轉染pACE-shRNA

7、2)。 4.構建靶向抑制大鼠ACE基因的shRNA重組腺病毒載體：利用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)，自先期構建的pACE-shRNA真核表達載體中酶切出ACE-shRNA片段，克隆入穿梭質粒pDC316中，然后將穿梭質粒pDC316-EGFP-ACE-shRNA.U6和腺病毒骨架質粒pBHGlox_E1，3Cre共轉染293細胞，包裝成重組的腺病毒載體Ad5-EGFP-ACE-shRNA并擴增、純化、鑒定。 5.腺病毒介導的

8、-ACE-shRNA對自發(fā)性高血壓大鼠的治療作用：自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為三組：①空白對照組(尾靜脈注射生理鹽水)；②病毒對照組(尾靜脈注射對照腺病毒Ad5-EGFP)；③治療組(尾靜脈注射Ad5-EGFP-ACE-shRNA)；同時設正常血壓對照組(尾靜脈注射生理鹽水)。以上各組大鼠均注射兩次，注射時間均為實驗的第1天和第16天。實驗期間做以下檢測：①注射前后檢測血壓、心率的變化。②首次注射后第3天，取治療組大鼠心肌、主動脈、腎臟組織

9、，做冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察腺病毒載體吸收情況。③首次注射后第3天，心臟體外采血用ELISA法檢測各組大鼠血清中ACE的含量，并且用RT-PCR及Western blot法檢測心肌、主動脈、腎臟組織中ACE mRNA及相應功能蛋白的差異表達。④實驗結束時，取各組大鼠心肌，做光鏡及電鏡切片，并檢測大鼠全心/體重、左心室/體重，及心肌羥脯氨酸、膠原蛋白的含量，以觀察心肌重構的變化。同時采血檢測肝腎功能。 結果： 1.經DN

10、A測序和酶切鑒定，證明我們構建的靶向抑制大鼠ACE基因的shRNA真核表達載體—重組質粒pACE-shRNAl與pACE-shRNA2無基因突變，符合實驗要求。 2.①植塊培養(yǎng)3天左右倒置相差顯微鏡觀察即可發(fā)現(xiàn)有內皮細胞從組織塊周圍移出，大約10天左右細胞開始融合成片，呈“鋪路石樣”。傳代培養(yǎng)的細胞和原代形態(tài)相似，生長較快，4～5天可以融合成單層，大概傳3～4代左右時，細胞開始變性變形、脫落，不再繼續(xù)生長。用免疫熒光法鑒定可見胞

11、漿內有大量綠色熒光表達。②根據(jù)轉染效率以及細胞生存率測定結果，篩選出質粒與轉染試劑復合物的最佳配比為pACE-shRNA 1.0μgMETAFECTENE 4μl，此時轉染效率為81.2％，細胞生存率為90.2％，優(yōu)于其他條件時的轉染效率并能保證較低的細胞毒性，故作為我們進一步實驗的最佳選擇。 3.pACE-shRNAl組與pACE-shRNA2組在轉染后48小時細胞內ACE mRNA及相應蛋白表達均明顯降低，與空白對照組和質粒

12、對照組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，72小時表達更低(P<0.01)。兩組相比，pACE-shRNA2組的抑制作用更強一些。而空白對照組與質粒對照組轉染前后各時間點ACE mRNA及相應蛋白的表達無明顯變化。 4.經限制性內切酶、PCR檢測和熒光顯微鏡觀察，證實成功構建了能夠表達ACE-shRNA的重組腺病毒載體并制備出高滴度的重組病毒。 5.①干預前SHR各組之間尾動脈壓差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而SHR

13、各組均與正常血壓對照組有顯著性差異(P<0.01)。SHR治療組于首次注射后第3天，尾動脈壓下降19mmHg±5mmHg，與治療前比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，降壓作用可持續(xù)14天左右，最大降壓幅度達22mmHg，注射后第16天時血壓開始回升；第2次注射后，尾動脈壓再次明顯下降20mmHg±6mmHg，降壓作用可持續(xù)15天左右，最大降壓幅度達21mmHg。而SHR空白對照組和病毒對照組尾動脈壓持續(xù)升高，正常血壓對照組尾動脈壓無明顯變

14、化。②熒光顯微鏡下可見心肌、主動脈、腎臟組織的冰凍切片有大量綠色熒光表達，說明Ad5-EGFP-ACE-shRNA可被富含ACE的組織大量吸收。⑧SHR治療組大鼠血清ACE含量(16.37ng/ml±3.90g/ml)明顯低于空白對照組(48.26ng/ml±1.50ng/ml)與病毒對照組(46.67ng/ml±2.82ng/ml)，心肌、主動脈、腎臟組織中ACE mRNA及相應蛋白表達較空白對照和病毒對照組也明顯降低(P<0.05)

15、，而與正常血壓對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。④光鏡切片顯示治療組心肌細胞肥大明顯減輕，電鏡切片顯示治療組心肌細胞超微結構明顯改善。左心室/體重之比與心肌膠原蛋白含量：治療組(2.24±0.19，1.283μg/mg±0.019μg/mg)顯著低于空白對照組(3.21±0.13，1.686tμg/mg±0.013μg/mg)與病毒對照組(3.13±0.12，1.682μg/mg±0.009μg/mg)，但還未降到正常血壓對照組水平(

16、2.06±0.11，1.25μg/mg±0.019μg/mg)。⑤整個實驗期間，各組大鼠心率及肝腎功能均無明顯變化。 結論： 1.成功構建了以大鼠ACE基因為靶位的真核表達載體pACE-shRNA。 2.通過血管植塊的方法可以實現(xiàn)大鼠動脈血管內皮細胞的原代培養(yǎng)并傳代，細胞純度在90％以上。經過優(yōu)化轉染條件，脂質體轉染劑METAFECTENE可以將重組質粒pACE-shRNA高效轉染入大鼠血管內皮細胞，并保證較低的

17、細胞毒性。 3.真核表達載體pACE-shRNA轉染進大鼠血管內皮細胞后可以有效地實現(xiàn)對靶基因mRNA的降解，進而抑制相應功能蛋白的表達。 4.成功構建了能夠表達ACE-shRNA的重組腺病毒載體。 5.腺病毒介導的．ACE-shRNA注射入自發(fā)性高血壓大鼠體內后，成功發(fā)揮了基因沉默作用，有效抑制了ACE mRNA及相應功能蛋白的表達，起到了明顯、持久的降壓作用，并且顯著改善了心肌重構，同時未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用。因